不对称PCR技术是向PCR体系中加入不等量的一对引物进行目标基因的扩增，在扩增后期中生成大量目标基因单链DNA（ssDNA）。利用不对称PCR技术产生带有标记物的单链DNA，通过结合其他技术如光学SPR生物传感器、纳米金比色法、电化学DNA生物传感器等实现快速灵敏检测目标基因片段的目的。江西师范大学生命科学学院（南昌市鄱阳湖湿地微生物资源开发与利用重点实验室）的山珊、*昭鸿和龙中儿*等人使用生物素标记的*力基因stx1与stx2的下游引物对目标基因进行不对称PCR扩增，生物素化的目标单链DNA与聚苯乙烯微球标记的目标基因的上游引物特异性结合形成结合物，结合物上的生物素与试纸条检测线上链霉亲和素结合而使检测线显色。此方法具有选择性高且快速、准确和安全的优点，结果判定便利、直观，可实现现场快速检测的目的，适用于基层实验室使用。
1不对称PCR上、下游引物添加比例的优化
在利用不对称PCR技术制备目标单链DNA的过程中，当限制性引物（上游引物）耗尽时，剩余过量的下游引物则以扩增前期所产生的双链DNA为模板，扩增出所对应的目标单链DNA，因此上、下游引物的添加比例是影响单链DNA产量的关键因素。考察stx1与stx2的最佳引物浓度添加比，结果如图1、2所示。随着下游引物添加量的增加，stx1相应单链PCR的产量随之升高（图2A），stx1在stx1F∶Biotin-stx1R浓度比为1∶7时，其制备的目标单链DNA进行免疫层析时的灰度值最高结果（图1），灰度平均值为.6。当stx2F∶Biotin-stx2R添加浓度比为1∶4时，制备的stx2的目标单链DNA进行免疫层析时的灰度值最高，灰度平均值为.3。继续提高stx2基因下游引物的添加量，相应目标单链DNA的随之减少，并出现了其他副产物（图2B）。导致免疫层析效果下降。
2不对称PCR循环数的优化
在不对称PCR过程中，循环扩增末期会产生大量的单链DNA产物，对不对称PCR反应循环数进行优化，结果如图3、4所示。实验结果显示随着循环数的增加，stx1目标单链DNA产物含量越多（图4），同时免疫层析法检测stx1的结果（图3）显示当循环数为65，检测线的灰度平均值最高为.4；对于stx2组，当循环数为55时，检测线的灰度平均值最高为.3，当循环数为65时，stx2的目标单链DNA产物免疫层析灰度值下降（图3），可能由于不对称PCR循环数增加导致单链扩增效率不高，因此目标单链DNA产物浓度下降，故选取循环数为55。
3不对称PCR退火温度的优化
如图5、6所示，stx2的最优退火温度为55℃，检测线灰度值为，stx1组在退火温度55～65℃期间，其检测线的平均灰度值均高于stx2组，当退火温度为59℃时所测得检测线的平均灰度值最大为。结果显示较低的退火温度对stx2制备的目标单链DNA进行检测更有利。最终选取55℃作为不对称PCR反应的退火温度。
4不对称PCR引物加入量的优化
不对称PCR体系中引物的添加量影响整个扩增过程中目标单链DNA产物的生成量，适当提升引物加入量能够增加扩增末期时所产生目标单链DNA。因此，对不对称PCR体系中引物加入量进行优化，结果如图7、8所示。随着体系中引物浓度的增加，目标单链DNA产物的生成量也随之增加，当stx1与stx2引物（上游引物浓度为2μmol/L）加入量为3μL时，stx1的检测线灰度值最高为（图7），stx2的检测线灰度值最高为，继续提高引物的浓度，对免疫层析效果没有显著影响。
5封闭剂对检测结果的影响
聚苯乙烯微球具有较强的物理吸附作用，合适的封闭剂可最大程度地减小实验过程中的非特异性吸附作用。如图9、10所示，在7种封闭剂中，当以甘氨酸和葡聚糖作为封闭剂时，阴性组中会出现微弱的非特异性条带。以OVA和鱼血浆阻断剂作为封闭剂的实验组20min后检测线灰度值较高，但在有效显色时间内（20min之内）显色速率慢于BSA实验组（图10）。明胶作为封闭剂会严重影响聚苯乙烯微球上DNA探针与目标单链DNA的特异性结合，进而导致实验组无法显色，因此选用BSA作为最终封闭剂。
6BSA添加量对检测结果的影响
少量的封闭剂导致聚苯乙烯微球表面封闭面积不足，进而产生非特异性吸附，过多的封闭剂会影响聚苯乙烯微球上DNA探针与目标单链DNA的特异性结合。如图11所示，当BSA添加量为20μL时，检测线的灰度值达到最大，为，同时阴性对照组未出现条带，随着BSA添加量的增加，阳性组检测线灰度值有不同程度地下降。
7免疫层析试纸条检测stx基因
利用所建立的方法对4株菌株进行stx基因检测，结果如图12所示，利用该方法可快速分型检测到STEC。
8特异性实验
为验证本实验建立并优化的快速分型STEC法的特异性，选取23株菌株进行stx基因的检测。结果显示，23株菌中STECCICC、CICC和CICC呈现stx阳性，其他非携带stx基因的菌株为阴性；结果显示该方法可准确检测到含有STEC标志性*力基因stx的菌株，且具有良好的特异性。
结论
通过建立一种基于不对称PCR结合免疫层析技术快速检测STEC标志性*力基因stx的方法，可实现快速、准确分型STEC的目的。该方法操作简便、检测成本低、检测结果准确以及特异性良好等特点，适用于基层实验室使用。
本文《不对称PCR技术结合免疫层析法快速检测产志贺*素大肠埃希氏菌》来源于《食品科学》年42卷2期-页，作者：山珊，*昭鸿，*艳梅，刘道峰，刘成伟，*运红，龙中儿。DOI:10./spkx2---。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
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