来源：中华创伤骨科杂志,,22(05):-.
近年来，开放性骨折和手术内植物相关骨髓炎占骨髓炎发病率的80%，其中有10%~30%的患者最终转归为慢性骨髓炎[1]。慢性骨髓炎发病率较40年前增加了近2倍[2]，达到了21.8/例，约23%的患者在骨移植前需2次以上清创；最终约6%的患者因感染无法控制需要截肢[3]。
临床上慢性骨髓炎常常出现骨组织坏死、硬化、瘘管和窦道形成[4]，伴长期流脓，感染反复发作；约60%以上的慢性骨髓炎患者中可检测到生物膜存在[5,6]，生物膜作为体内定植细菌的集合体，存在于软组织、骨和内植物表面、骨髓腔中[7]，是骨髓炎中"骨"、"细菌"、"抗生素"和"免疫"的直接作用介质，除了通过播散细菌和内*素等直接诱导骨细胞和血管内皮细胞凋亡，破坏骨质和血供，还会引发免疫偏移、炎症级联反应等间接破坏骨质，更重要的是，生物膜不仅可以使内部细菌有远超浮游细菌的耐受性，还可以直接降低抗生素浓度，抑制免疫细胞吞噬和免疫因子的结合[8]；生物膜实现其功能的具体的分子机制和不同通路、因子间的关系尚未完全阐明，其中涉及的信号因子和通路包括杀白细胞素、γ溶血素AB（γ-hemolysinAB）、ppGpp信号转导分子、白细胞介素(interleukin,IL)-12、IL-1β、CC类趋化因子配体5[chemokine(C-Cmotif)ligand5,CCL5]、*素-抗*素系统、Agr群体感应系统和LuxS/AI-2群体感应系统等，各信号分子、通路间相互联系，调节生物膜和细菌的生理活动。
本文以"bacterialbiofilm"、"chronicosteomyelitis"、"antibiotic"、"immune"、"quorumsensing"为关键词在PubMed和WebofScience数据库进行检索，以"慢性骨髓炎"、"细菌生物膜"、"抗生素"、"免疫"、"群体感应"为关键词在中国知网、万方和维普数据库进行检索，检索时间为年1月至年8月。文献纳入标准：①生物膜在骨髓炎中形成机制的研究，②生物膜对抗生素影响的研究，③生物膜对自体免疫的影响的研究，④生物膜对所包含的细菌影响的研究。文献排除标准：①研究质量较低的文献，②研究内容与纳入标准不一致的文献，③内容重复的文献。共查阅文献篇，排除篇文献，最终纳入文献55篇，其中英文文献41篇，中文文献14篇，现就慢性骨髓炎中生物膜的致病机理和研究进展进行综述。
一、生物膜的结构和形成机制
"生物膜（biofilm）"的概念是Costertan教授于年首次提出，为定植在体内粘膜或内植物表面的"定植菌落"，定植菌落主要由细菌和其自身分泌的聚合基质组成，不可逆黏附在粘膜或内植物表面，与体液中的浮游细菌相对应，具有特殊的内部生态环境和细菌基因的表型改变[9]。生物膜的构成通常是10%~25%的细菌被75%~90%的自身分泌的胞外聚合物（extracellularpolymericsubstances,EPS）所包裹，EPS的主要成分是水（97%）、多糖（2%）、蛋白质（1%~2%）、eDNA（1%~2%）和阳离子。生物膜的主要结构是由多糖的组成和结构决定的，对于葡萄球菌生物膜，多糖成分是细胞间脂多糖黏附素（polysaccharideintercellularantigen,PIA）。
临床研究显示，引发骨髓炎的细菌种类中革兰阴性菌约占43.41%，革兰阴性菌中铜绿假单胞菌检出率最高（26.90%），革兰阳性菌约占56.59%，革兰阳性菌中检出率最高的是金*色葡萄球菌属病菌（58.20%）[10]。生物膜感染的骨髓炎多是亚急性或慢性骨髓炎，普遍在创伤后或术后3-10周后出现[11]；骨髓炎的生物膜的细菌来源于内植物表面或开放性创伤污染所携带的浮游细菌（planktonicbacteria），骨折区域因创伤、手术和内植物植入会破坏骨膜和软组织，导致局部血供变差，软组织瘢痕；内植物作为体内异物，会激活免疫反应，引发中性粒细胞耗竭，形成局部免疫低下的纤维炎症区；浮游细菌通过前期可逆的被动黏附（静电作用力/疏水间作用力）在这一区域的骨质或内植物表面，增殖形成微群落（microcolony）；随着细菌密度的增高，细菌间的群体感应系统调节细菌产生大量胞外多糖和黏附因子（胶原黏附素/纤连蛋白黏附素），形成不可逆的主动黏附的定植菌落，即生物膜。不同种类细菌形成生物膜的黏附因子和胞外多糖有显著差异，以葡萄球菌为代表的革兰阳性菌的胞外多糖成分主要是聚乙酰氨基葡萄糖（poly-N-acetylglucosamine，PNAG），而以假单胞菌为代表的革兰阴性菌的胞外多糖成分中则含有鼠李糖脂（rhamnolipids）[12]；黏附因子的差异更有特异性，同种菌属不同菌种的黏附因子也不一样，如大肠杆菌的黏附因子是curli（CsgA），而枯草芽孢杆菌的黏附因子是fiber（TasA）[13]。
二、生物膜在骨髓炎中的屏障作用
生物膜对抗生素的屏障作用主要由细菌分泌的EPS实现，主要通过休眠细菌（persisters）提高对抗生素的耐受性[12]。生物膜的屏障抗生素、休眠细菌作用显著降低了细菌感染所需的数量阈值，体外抗生素抑菌实验中，同种细菌的最小抑生物膜浓度约是最小抑菌浓度的倍，体内实验中，形成相同的感染状态，内植物表面不存在生物膜时所需的细菌数量是存在生物膜时所需细菌数量的倍[14]。
（一）屏障抗生素(图1)
图1
生物膜扫描电镜照片：白色箭头是生物膜，蓝色箭头是红细胞，标本取自骨髓炎患者，菌株为多重耐药的阴沟肠杆菌
生物膜的存在可以显著降低万古霉素、替考拉宁等抗生素的渗透；具体屏障原理可分为：①生物膜的疏水性结构：生物膜胞外聚合物的主要构成是水，但胞外聚合物并不是亲水性的，胞外聚合物通过多糖和蛋白质等成分将"自由水"改造成水团（watercluster），水团的分子量随着生物膜的成熟而增长，水团的性质也发生改变，大分子量的水团往往是疏水性的，疏水性的大分子量水团倾向于在生物膜表层，形成一层疏水性的膜，这层疏水性的膜使生物膜在体液中保持相对稳定，添加重金属离子（如铬）破坏大分子水团，消除疏水性，生物膜会瓦解分散[15]；而小分子量的水团倾向于在生物膜内部，呈亲水性，这种内部亲水-外部疏水的两性结构使大多数从肾脏排泄的亲水性的抗生素都难以渗透，在生物膜内达不到有效浓度；②生物膜的负电荷和酸性环境：因为生物膜的胞外聚合物和细菌的细胞壁都含有大量多糖和壁磷酸，生物膜呈负电荷性[16,17]，这使得如氨基糖苷类抗生素这样带有正电性的分子被静电作用结合在了EPS上，阻止了抗生素的进一步渗透。实验证明，生物膜内部的pH与生物膜表面的pH差值可大于1，这可能是由于负电荷吸引的H+聚集，也可能是因为细菌酸性代谢产物的堆积，生物膜内外显著的pH梯度会直接影响抗生素的活性。③生物膜对抗生素的直接灭活：生物膜中除了含有结构性蛋白质，也含有功能性蛋白质，如细菌分泌的β-内酰胺酶[18]，在生物膜EPS的保护下，细菌的外排酶可以保持浓度和活性，在细菌体外就讲抗生素分解灭活。但生物膜的屏障作用并不是对所有抗生素都有效，对利福平、克林霉素和大环内酯类抗生素的屏障作用就并不明显。④中性粒细胞外陷阱（neutrophilextracellulartraps，NETs）加厚生物膜屏障：NETs是中性粒细胞释放到胞外的网状纤维结构-以DNA作为基本结构骨架,其上间隙附着大量的蛋白质结构，NETs作为机体一种细胞免疫防御机制能有效控制微生物感染的扩散，避免细菌扩散到脑、睾等重要器官；研究表明，细菌生物膜通过杀白细胞素（panton-valentineleukocidins）和γ溶血素AB引发中性粒细胞释放NETs[19]，但NETs反过来也会加快、加厚生物膜形成，这种正反馈最终形成了包含NETs的厚实紧致的生物膜，这种屏障可以阻止细菌的扩散，但也会使细菌生物膜对抗生素和白细胞产生抗性[20]，也就是说，体内的细菌生物膜的EPS并不都是细菌自身分泌的，而是细菌生物膜与宿主的内环境共同打造的，体内实验证明NETs是生物膜在体内存活所必须的。
（二）休眠细菌提高细菌耐受性
休眠细菌的基因组没有变异，而是通过改变细菌的转录和翻译使细菌处于较低的新陈代谢水平，减少对外界物质的摄入，从而对抗生素有低敏感度；也就提高了整个菌群对抗生素的耐受性。生物膜中的EPS通过屏障作用降低了生物膜内抗生素的浓度，也使生物膜深层的细菌缺乏营养和氧气，使深层大部分细菌处于休眠状态[21]，细菌进入休眠状态的机制是*素-抗*素系统（toxin-antitoxinsystems,TA）[22]介导的，TA系统基因的位置在细菌染色体上，主要功能是应对外界刺激时调控细菌的新陈代谢和生长速率，TA系统一般被认为由两部分组成，一个稳定降解慢但含量少的*素，能够干扰抑制细菌必要的新陈代谢的物质，如能通过降解mRNA来干扰转录，通常是蛋白质，和一个相对不稳定降解快但含量多的抗*素，抑制*素的*性，通常是RNA或蛋白质，抗*素和*素被认为是转录在同一条mRNA上，抗*素的编码链在*素之前，翻译生成的抗*素会以二聚体的形式结合*素，再结合在后续翻译*素的编码链的启动子上，生长期时，抗*素/*素比例1，大部分*素被抗*素结合，*素的翻译被抑制，细菌呈生长状态。当外界刺激如缺乏营养、低氧、抗生素等直接刺激细菌或通过二级信号分子如ppGpp[23]间接激活TA系统，抗*素合成数量减少，抗*素/*素1，多余的游离*素可以解除抗*素*素聚合体对mRNA启动子的结合，解除*素翻译的抑制，翻译出的大量*素可以普遍分解mRNA，*素也会分解自身mRNA，造成*素和抗*素的转录都减少，但是抗*素的降解远快于*素，形成一个正反馈，造成*素处于支配地位，全面抑制菌体的新陈代谢和生长[24]。
三、生物膜在骨髓炎中的免疫抑制作用
生物膜可以抵抗宿主的特异性和非特异性免疫，在细菌的免疫逃避中起重要作用；研究证明，金葡菌自身对免疫系统的抵抗作用很有限，主要依靠生物膜来完成免疫逃避；实验证明，生物膜与宿主免疫间是不对称关系，即生物膜可以引发相应的免疫反应，但免疫反应无法有效的将生物膜清除[25]。从生物膜结构来看，生物膜EPS紧密包裹细菌，巨噬细胞在渗透生物膜的过程中被细菌分泌的α-*素和杀白细胞素AB干扰，丧失免疫吞噬功能[26]；铜绿假单胞菌的Psl多糖还可以保护细菌免受调理作用[27]；生物膜中的蛋白酶如丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶可以降解免疫系统分泌的免疫球蛋白和抗菌肽；从分子生物学角度，生物膜通过白介素-12、IL-1β、CCL5等细胞因子和趋化因子吸引骨髓源性抑制细胞（MDSCs）[28]，影响巨噬细胞的极化，将本应促炎、杀菌的固有免疫（M1型）偏移为抗炎、成纤维化的免疫反应（M2型），导致局部免疫抑制，过度纤维化，瘢痕形成[29]。
四、生物膜在骨髓炎中的*素及遗传信息传递作用(图2)
图2
生物膜在慢性骨髓炎中的作用模拟图
慢性骨髓炎的临床症状主要是由生物膜成熟后释放的浮游细菌所引起的。生物膜的分离播散是一个主动过程，受细菌间群体感应的调节[30]，生物膜形成早期，膜内细菌数量较少，细菌主要产生表面黏连蛋白和多糖，促进细菌黏附在骨或内植物表面，当细菌密度到达一定程度时，细菌主要分泌蛋白酶、酯酶等使生物膜裂解播散[31]，释放的金葡菌可以侵袭血管内皮细胞、成骨细胞从而诱导细胞凋亡[32]。生物膜还具有直接吸收骨骼的能力[33]，可以在体外没有免疫和破骨细胞的存在下破坏骨质。革兰阴性菌还会产生内*素，引发免疫反应。细菌可以改变生物膜EPS中多糖的成分来控制生物膜的形成和播散，从而适应不同时期生物膜的需求[34]。
细菌在生物膜内增殖过程中，会产生一些次级代谢产物作为信号分子，当信号分子达到阈值浓度，便可与细菌内的受体结合，调控目的基因的转录，使细菌在多细胞水平上作为整体完成重要的生理功能，这一调控系统称为群体感应系统（quorumsensing，QS）。在革兰阴性菌中信号分子是酰基高丝氨酸内酯（AcylHyperserineLactone，AHL），在革兰阳性菌中信号分子是自诱导肽，不同种类的细菌间也可以通过细菌硫代谢中甲基循环中的副产物二型自诱导物（autoinducer-2，AI-2）进行细菌间信号沟通。大部分细菌都含有两套或两套以上的群体感应系统，生物膜内细菌基因表达谱的改变是受多个群体感应系统所组成的调控网络控制的，如：LuxS/AI-2群体感应系统通过二元信号系统KdpDE调控细菌多糖的的表达[35]，而Agr群体感应系统调控金葡菌的大部分*性因子[36]，二者综合诱导细菌生物膜的表型变化。生物膜EPS还可以与质粒结合，促进细菌间的耐药性遗传信息的水平传递，加快非耐药菌向耐药菌转化[37]。细菌通过构建生物膜，实现了细菌间的信息沟通，从而协调合作，比单独的浮游细菌能更好的适应外界环境变化。
综上所述，近年来骨髓炎的治疗手段由过去的清创术转为现在的清创+Masquelet骨重建术[38]或截骨+llizarov骨搬运术[39,40]或负压封闭引流术+游离肌皮瓣移植治疗术[41,42,43]，治疗效果有了显著提升，但手术次数多，疗程长，二次创伤大，患者依从性差，生物膜的存在使骨髓炎感染极其顽固，仅靠外科技术和抗生素的治疗策略难以很好的解决。因此，研究生物膜在骨髓炎中的作用，明确生物膜在骨髓炎中发挥作用的机制和通路是未来研究的趋势，应用针对生物膜的治疗策略辅助抗生素和外科清创是慢性骨髓炎的临床转化热点。如使用材料携带抗生素在生物膜内达到有效浓度[44,45,46,47,48]或利用内植物表面涂层抑制生物膜黏附[49,50]；干预细菌群体感应的通路，使生物膜自我瓦解[51]；添加针对休眠细菌的抗生素辅助剂与常规抗生素联用，消除残余细菌池[22,52]；调节免疫功能，抑制免疫极化倾斜[53]；添加eDNA酶[54]或多糖裂解酶[55]或噬菌体裂解酶[42]，分解生物膜EPS和NETs的组成成分，分散松解生物膜。随着对生物膜在骨髓炎中的分子生物学、信号转导研究的深入，慢性骨髓炎的研究和治疗将更为精细。
参考文献略
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