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脓*症是一种由感染引起的以多器官功能障碍为特征的危重疾病，医院死亡的主要原因，常伴有凝血障碍。最严重的凝血障碍称为弥散性血管内凝血（DIC），表现为凝血级联的全身性活化，纤维蛋白沉积和血小板在全身微血管中聚集。这种致病过程损害了各器官的血液供应，从而促进多器官功能障碍。DIC也可导致凝血因子和血小板的过度消耗，导致不同部位明显出血。DIC的发生显著增加了脓*症患者的死亡率。尽管在脓*症发病后进行抗凝治疗并不能改善一些临床试验的总体结果，但使用肝素（一种众所周知的抗凝剂）进行预处理，显著改善了临床前环境下的器官损伤和败血症致死率。
细菌内*素（lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性菌的主要细胞壁成分，能刺激单核细胞或血管内皮细胞表达组织因子（tissuefactor，TF），一种激活外源性凝血级联反应的跨膜糖蛋白。骨髓细胞中TF表达减少或缺失的小鼠在内*素血症中凝血活性显著降低。同样，用中和抗体抑制TF活性也可以预防LPS诱导的DIC，TF的生物活性在转录后受到多种机制的调节，包括细胞表面促凝磷脂酰丝氨酸（PS）和巯基二硫交换的可用性。在生理条件下，大多数PS位于细胞质膜的内层，但是它们的外化显著增加了TF的促凝活性。是DIC的共同原因，革兰氏阴性脓*症诱导外周血白细胞中大量PS外化。药理学阻断细胞表面PS或其蛋白二硫键异构酶介导的巯基二硫键交换显著减弱革兰氏阴性脓*症诱导的DIC。最近的研究表明，蛋白质二硫键异构酶介导的巯基二硫键交换对TF的激活也很关键。尽管已知细菌感染和LPS诱导TF的表达，革兰氏阴性菌或脂多糖通过PS外化或硫醇二硫化物交换促进TF活化的潜在机制仍不清楚。
1型干扰素（IFN）是一种广泛表达的细胞因子，在多种病*和细菌感染的反应中很容易被诱导并形成抗菌天然免疫反应。包括IFN在内的1型干扰素-ɑ和干扰素-β,通过细胞表面受体IFN-α/β发出信号激活JAK-STAT通路，导致STAT1-STAT2二聚体形成和核易位。这种作用导致IFN刺激的基因表达上调，这些基因协同工作以增强对病*感染的抵抗力。除病*核酸外，革兰氏阴性菌或脂多糖也可通过Toll样受体4（TLR4）和含TIR结构域的适配器诱导干扰素刺激1型干扰素-β的表达。(TRIF）是TLR4下游的一种衔接分子，尽管众所周知1型干扰素是抵御病*感染的第一道防线，但1型干扰素在革兰氏阴性细菌感染诱导的DIC中的作用仍不清楚。在这里，我们发现1型干扰素信号介导革兰氏阴性菌或脂多糖诱导的凝血通过放大效应物的释放，如高迁移率族框1（HMGB1）到细胞外空间。通过遗传或药理学方法阻断这一途径可防止革兰氏阴性脓*症或内*素血症患者发生DIC。在机制上，细胞外HMGB1通过促进细胞表面PS的暴露而显著增加TF的促凝活性，至少部分是这样，这对于凝血级联的辅因子-蛋白酶复合物的组装很重要。
1型干扰素信号转导介导内*素血症凝血级联反应的激活
为了确定1型干扰素信号在内*素血症凝血级联激活中的作用，我们将凝血酶的内猝灭5-FAM/QXL-FRET底物引入WT小鼠或干扰素-α/β的循环中R1缺陷小鼠。当内源性活性凝血酶切割时，血管内产生绿色荧光信号，在内*素血症期间可通过活体显微镜检测到。值得注意的是，基因缺失的干扰素-α/βR1几乎完全阻断了整个肝脏微血管中血管内凝血酶的生成。我们还观察到IFN-α/β可减少血小板聚集、纤维蛋白沉积和微循环阻塞R1缺陷小鼠或肝素预处理小鼠与其WT对照组相比。免疫组化染色也显示内*素血症时肝和肺中纤维蛋白沉积。凝血级联的过度激活导致纤维蛋白原的消耗增加，并通过纤溶酶介导的纤维蛋白降解增加D-二聚体的产生。DIC的4个标志物包括凝血激活过程中形成的凝血酶-抗凝血酶（TAT）复合物，纤溶酶原激活物抑制剂1型（PAI-1），一种导致血小板减少的纤维蛋白溶解和血小板活化的抑制剂R1抑制血浆TAT复合物、D-二聚体和PAI-1的增加。此外，干扰素-α/β的丢失R1显著减轻内*素血症引起的血小板减少。干扰素-α/β的缺失R1显著提高内*素休克小鼠的存活率。然而，干扰素-α/β的缺失R1未能影响FeCl3诱导的血栓形成。综上所述，这些发现表明1型IFN信号介导LPS诱导的凝血级联激活。
TRIF对内*素血症凝血级联反应的激活至关重要
TRIF是TLR4下游的一种衔接分子，是LPS诱导的1型IFN表达所必需的。为了进一步证实1型IFN信号对LPS诱导的凝血级联活化至关重要，TRIF-KO小鼠及其WT对照组受到内*素血症的影响。正如预期的那样，TRIF的缺失阻断了1型IFN在肺、脾脏和内脏中的表达，并抑制了1型IFN的分泌。在内*素血症期间，TRIF的缺失显著抑制血管内凝血酶生成、血小板聚集、纤维蛋白沉积和微血管闭塞。免疫组化染色进一步显示TRIF缺乏和WT内*素血症小鼠肝脏和肺部的纤维蛋白沉积。此外，TRIF的丢失抑制了内*素血症时血小板的减少和血浆TAT复合物、D-二聚体和PAI-1的增加。此外，TRIF的缺失显著提高了致死性内*素血症的存活率
MyD88是TLR4下游的另一个衔接分子，对LPS诱导的促炎细胞因子的产生很重要。为了研究MyD88在LPS诱导的凝血中的作用，MyD88缺陷小鼠及其WT对照组受到LPS的攻击。在内*素血症期间，MyD88的缺失完全阻断了肿瘤坏死因子（TNF）的释放。相比之下，MyD88缺乏仅轻微减弱LPS诱导的凝血。除了诱导产生1型干扰素外，TRIF信号还能够激活NF-κ为了确定NF-kB激活在LPS诱导的凝血中的作用，我们在药理学上抑制了IκB激酶β(IKKβ),这是LPS诱导NF-κB所必需的激活。IKKβ的管理在内*素血症期间，抑制剂MLB阻断TNF释放，但增强凝血酶生成、血小板聚集和微血管闭塞。此外，给予MLB可促进TAT复合物和PAI-1在内*素血症中的增加。这些发现与之前的一篇报道一致，该报道显示IKKβ的药理抑制作用或IKKβ基因缺失骨髓细胞促进LPS诱导的致死性。综合起来，这些发现进一步支持1型干扰素信号介导LPS诱导的凝血级联活化的观点。
1型干扰素信号转导介导细菌败血症凝血级联反应的激活
为了确定1型干扰素信号是否介导了细菌性败血症的凝血病变，干扰素-α/βR1-KO小鼠、TRIF-KO小鼠及其WT对照组接受CLP，这是一种多微生物败血症的临床相关小鼠模型。值得注意的是，CLP在WT小鼠的肝微血管内诱导强大的凝血酶生成和血小板聚集，而不是IFN-α/βR1KO或TRIFKO小鼠。免疫组化染色显示CLP诱导的小鼠败血症中肝和肺中有纤维蛋白沉积。一直以来，干扰素-α/β的丢失R1或TRIF阻止血小板减少和血浆TAT复合物、D-二聚体和PAI-1的增加。此外，干扰素-α/βR1缺乏或TRIF缺乏可使肝脏、肺和脾脏中的细菌负荷轻微降低，并显著提高实验性败血症的存活率。因此，1型干扰素信号介导了细菌败血症凝血级联的激活。
1型干扰素信号通过放大HMGB1释放到血液中介导凝血级联的激活
接下来我们研究了1型IFN信号转导介导LPS诱导的凝血级联激活的机制。HMGB1是一种进化上保守的蛋白质，几乎在哺乳动物的所有类型的细胞中都有表达。细菌败血症或内*素血症导致HMGB1在循环中全身积聚，用单克隆抗体中和循环中的HMGB1可显著促进细菌败血症的存活。我们先前发现1型干扰素信号在其核位置序列介导HMGB1高乙酰化，最终导致HMGB1在细胞质中积累，随后释放到细胞外空间。与先前的研究一致，TRIF或IFN-α/β缺失R1阻断内*素血症时HMGB1的释放。相反，MyD88的缺失未能抑制LPS诱导的HMGB1释放。在内*素血症和细菌性败血症中，我们还观察到血浆TAT水平与循环HMGB1浓度相关，而与血浆TNF水平无关。
结合发现脓*症患者血浆HMGB1水平与DIC评分相关，我们假设1型干扰素信号可能通过HMGB1释放到循环中介导LPS诱导的凝血级联激活。由于骨髓细胞和肝细胞在炎症或缺氧期间都显示出主动和被动释放HMGB1，我们在骨髓细胞（Hmgb1f/fLyz2cre+）或肝细胞（Hmgb1f/fAlbcre+）中产生选择性HMGB1缺失的小鼠。尽管Hmgb1的整体缺失导致出生后早期死亡，但这些转基因小鼠在生理条件下未显示出可检测的缺陷。与我们之前的观察结果一致，我们发现肝细胞而非髓细胞是内*素血症期间血浆Hmgb1浓度增加的主要来源。值得注意的是，在内*素血症期间，肝细胞（而非髓细胞）HMGB1的缺失显著减弱肝脏中的纤维蛋白沉积。在内*素血症期间，肝细胞HMGB1的丢失显著抑制血管内凝血酶的产生和血小板的聚集。肝细胞HMGB1缺乏降低内*素血症患者血浆TAT复合物和PAI-1。通过免疫组织化学染色检测肝和肺中的纤维蛋白沉积。以往的研究报道血小板是血栓内HMGB1的主要来源，血小板衍生的HMGB1是损伤诱导体内血栓形成的关键介质。然而，使用2种转基因小鼠模型，对血小板内HMGB1的特异性消融（HMGB1fl/fl，我们发现血小板衍生的HMGB1不是HMGB1的主要来源，血小板或造血细胞缺乏HMGB1不能阻止内*素血症和败血症患者血浆TAT复合物和PAI-1的增加。重要的是，抗HMGB1单克隆抗体的施用以类似于HMGB1缺失的方式显著减轻LPS诱导的凝血病。总之，我们的数据证实1型干扰素信号通过调节HMGB1释放到血液中，介导凝血级联的激活，至少部分。
1型干扰素信号和HMGB1通过PS暴露介导内*素血症中TF依赖性凝血病变
接下来我们研究了1型干扰素和HMGB1介导LPS诱导的凝血病变的机制。与先前的结果相似，表达低水平TF的小鼠在内*素血症中显著降低凝血活性，表明TF在LPS诱导的DIC发展中起关键作用。骨髓细胞（如巨噬细胞）中表达的TF在DIC的发展中起着关键作用。根据这一发现，使用氯膦酸脂质体消耗巨噬细胞在内*素血症中显著减弱凝血酶生成和血小板聚集并降低TAT复合物和PAI-1的血浆浓度。因为先前的研究表明重组HMGB1能够刺激巨噬细胞和内皮细胞中TF的表达，我们接下来测试HMGB1是否通过上调TF表达介导LPS诱导的凝血病变。然而，干扰素-α/β的缺失R1、TRIF或肝细胞HMGB1不能影响肺、肝和脾脏中的TF表达。TF表达水平与血浆TAT水平无关。这些观察结果促使我们在翻译后水平上测试1型干扰素/高分子量蛋白1通路是否促进内*素血症中的TF活性。
PS增加TF活性并增强凝血级联的组装辅因子-蛋白酶复合物。在生理条件下，大多数PS定位于细胞质膜的内层。革兰氏阴性败血症诱导PS在外周白细胞中外化，但是，细胞表面PS的阻断显著减弱细菌败血症诱导的DIC。与先前的研究结果一致，LPS激发诱导外周血白细胞和脾细胞中PS的强烈外化。给予众所周知的PS结合蛋白MFG-E8可显著减轻内*素诱导的凝血病。值得注意的是，干扰素-α/β的缺失R1、TRIF或肝细胞HMGB1均能降低内*素诱导的外周血白细胞和脾细胞PS外化。综上所述，这些数据表明1型干扰素和HMGB1在内*素血症中介导TF依赖性凝血病，至少部分通过PS暴露。
细胞外HMGB1通过caspase-11诱导PS暴露和TF激活
我们接下来研究了细胞外HMGB1介导PS暴露和TF依赖性凝血病的机制。最近的研究表明，半胱氨酸蛋白酶-11及其底物气皮蛋白D（GSDMD）在内*素血症中触发凝血级联的TF依赖性激活。再加上我们最近的发现，HMGB1通过将LPS输送到细胞质中介导败血症中半胱氨酸蛋白酶-11依赖性的致死性，我们推断细胞外HMGB1可能通过caspase-11在LPS存在下诱导PS外化和TF活化。如共聚焦显微镜所示，重组HMGB1或超纯LPS单独不能在培养的小鼠腹腔巨噬细胞中诱导可检测到的PS外化。然而，添加HMGB1和超纯LPS可诱导野生型小鼠腹腔巨噬细胞产生大量PS，但不诱导缺乏caspase-11的小鼠腹腔巨噬细胞产生PS。因此，HMGB1以时间依赖性方式增加WT中的TF促凝活性，但不增加缺乏半胱氨酸蛋白酶-11的小鼠腹腔巨噬细胞中的TF促凝活性。在LPS存在下，HMGB1不能诱导GSDMD-KO小鼠腹腔巨噬细胞PS外化
与体内实验结果一致，细胞外HMGB1在LPS存在下不影响TF的表达。使用MFG-E8中和PS可显著降低细胞表面TF活性，而不改变TF的表达。此外，降低GSDMD激活后PS暴露所需的磷脂酶TMEM16F的表达，显著抑制HMGB1和LPS刺激的巨噬细胞中的PS暴露和TF激活，而不影响TF表达。与超纯LPS不同，已知粗LPS激活炎症小体。因此，粗LPS而非超纯LPS以GSDMD依赖性方式诱导PS暴露和TF激活。此外，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-11的缺失或肝素的施用显著降低了内*素血症患者血浆中TAT和PAI-1的水平。这些结果表明，细胞外HMGB1通过caspase-11依赖和GSDMD依赖机制诱导PS暴露和TF激活。
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