Hello，中科普瑞的广大朋友们和小伙伴们，二〇二〇年的甲基化文献来啦！小编继续保持严谨认真的态度，不啰嗦，直接上干货。
今年共搜罗和统计到甲基化芯片的SCI文献篇，累积影响因子.，平均影响因子5.。其中10分以上的22篇（包括中科普瑞科技服务和合作的文献两篇），5分~10分的67篇。关键词频统计显示，三大关键词为Associated、Profile、Cancer，分别对应EWAS关联分析、甲基化景观以及肿瘤研究，其他的研究方向还包括遗传疾病、怀孕与新生儿、疾病风险预测、早筛、慢性病、环境暴露以及生信算法相关等相关研究。另外，词频还显示出研究的样本以全血和组织样本为主。今年MethylationEPIC（K）芯片的文章数量终于赶上了K文章的数量，两种芯片文献数量持平，各约90多篇左右。相比往年的文章数量，文章影响因子，甲基化芯片的应用和报道呈现稳步前向推进的趋势。
从投稿的杂志来看，10分以上的文献主要集中在医学大类，专业性的高分杂志，包括《JClinOncol》、《Gut》、《DiabetesCare》、《Hepatology》、《ActaNeuropathol》、《MolPsychiatry》《PLoSMed》等，其余的文章选投在生物学大类和综合性杂志，如《NatProtoc》、《GenomeMed》，《NatCommun》。5~10分的文章，除了医学、生物学，包括环境科学与生态学，如《EnvironHealthPerspect》《EnvironInt》、《EnvironPollut》。最后，5分上下有三本杂志文章选投较多，分别是《ClinEpigenetics》（5.）、《IntJMolSci》（4.）、《Epigenetics》（4.）。尽管《ClinEpigenetics》这本杂志分不高，但是其中不乏一些实验设计、数据分析比较有意思的文章。
中科普瑞合作文献
TOP1：三期临床试验证明低度神经胶质瘤中辅助放化疗比放疗更具生存效益
年影响因子最高的文献来自于俄亥俄州立大学，第一作者是EricaH.Bell。该文献是一项临床三期研究：低度神经胶质瘤（LGG）分子亚组生存结局的存在高度可变性，旨在评估当患者在NRGOncology/RTOG上接受放疗后化疗（PCV）与单独放疗相比，WHO的分子亚组是否具有预后和预测价值。结果表明，具有IDH突变的高危LGG患者均应考虑使用PCV方案，IDH野生型的高危LGG需要更加积极的治疗方案并考虑开展临床试验。该文章应用K了开展了MGMT启动子甲基化的分析，拷贝数变异分析。
其实我们在各类杂志上，多少都会看到分型的研究，但分数参差不齐。利用分子分型指导临床是绝大多数医学工作者的目标，这篇32.分的文章的核心在于评估了WHO的分子分型及预后价值，并能指导临床治疗，这项研究报道的临床意义直接拉满。
时间回到年，同样是分型研究的亚洲癌症研究组ACRG，旨在通过分子分型（多组学数据）为胃癌的临床提供有用信息，将胃癌分型四型（MSI、MSS/EMT、MSS/TP53+、MSS/TP53-）。三年后的年TCGA在此基础上继续发展到五型（EBV、MSI、CIN、GS、）。尽管这两篇文献非常华丽，分数极高，但实际的临床价值却微乎其微，曾一度饱受争议。
胃癌分型（左：ACRG，右：TCGA）
这两年，DNA甲基化在临床分型研究以及早筛预后的分子标志物研究上风生水起，如火如荼。年，《Nature》上刊登了德国专家应用甲基化芯片区分82种神经系统肿瘤的分类器，目前国内已有临检公司应用该分类器出具分型检测报告。年伦敦卫生科学中心分子遗传实验室应用K甲基化芯片识别10多种遗传疾病，随后在年春季发表文献将识别种类扩大到42种并实现商业化。年12月，刚刚与英国国民医疗服务体系（NHS）达成合作的GRAIL公司应用甲基化捕获测序技术，为英国病人提供多种肿瘤的液体活检早筛检测。这几年DNA甲基化研究报道增多，频率升高，目标直奔临床转化和商业化。这些专家学者应用DNA甲基化检测技术在筛查和检测板块创造了香甜可口的蛋糕，成为众多资本的青睐对象。这也显示出DNA甲基化的独特的魅力和价值，在分型和标志物的众多候选分子中脱颖而出，站在了生命科学前沿的风口浪尖。
甲基化芯片数据对神经肿瘤分型（左）和遗传疾病识别（右）
EWAS成为多领域研究的重要分析方法
EWAS全称Epigenome-WideAssociationStudy，表观全基因组关联分析，这是一种非常实用的分析手段或者称为统计方法。EWAS的核心是回归分析，用于确定两种或多种变量之间的相互依赖关系，通常意义上的EWAS研究指的是DNA甲基化变异与表型（或疾病、特征、环境等）之间的相互关系。如果纳入分析的数据是多套，则还可以研究数据之间的因果或介导关系，比如cg部分介导了他汀药物治疗II型糖尿病的效果（换句话说就是：他汀类药物先改变了cg的甲基化水平，从而调控了ABCG1基因表达，从而起到了治疗II性糖尿病的效果）。
基于EWAS分析结果的中介效应展示
在今年的22篇IF10的文章中，有14篇为EWAS研究的文献，研究内容如下：
从上表以及词频分析，我们可以看到了的EWAS研究在表观遗传范畴研究是非常重要的。小编总结了以下几点因素：第一，关联分析可以高效的整合多个数据集，在增大样本量的同时，通过回归方程校正混杂因素，使得真正Association的甲基化位点从众多位点中“脱颖而出”，能够避免常规差异分析带来的假阳性和假阴性；第二，从目前的大多关联分析研究，我们可以看到来自于组织样本的表观遗传差异通常很大，而来自血液样本的变异通常较小，当我们以血液为研究样本时候，这些差异较小的甲基化变异常常在差异分析中被忽略掉，这时候大样本的EWAS分析就能更加灵敏的识别到这些变异；第三，基于多套数据的EWAS研究，不仅可以发现关联，还能够通过统计学分析阐明因果关系，比如环境诸如外界环境、单核苷酸多态视为原因，DNA甲基化视为中间因素，表型视为结局；又比如表格中8的文章，利用孟德尔随机化发现血液中的表观遗传变异是侵袭性淋巴癌的结果，而非原因。
EWAS曼哈顿图展示和位点功能展示
从研究角度来看，不同的研究单位切入点不尽相同。比如上表三篇孕妇与新生儿研究当中，第一篇从妊娠糖尿病与新生儿结局切入，第二篇从早产角度切入，第三篇从孕妇饮食、运动改善的角度出发。这些不同角度的切入使人们对认识到孕妇与新生儿之间密切联系更加立体，多维度补充科学依据。又比如精神分裂症，第一篇利用Meta分析精神分裂症的表观遗传风险血液标志物，建立血液样本的精神分裂症的风险位点，第二篇则聚焦到首发精神病研究上，排除了用药治疗和疾病进展的干扰。
EWAS分析首发精神分裂症的差异位点展示
从数据分析上来看，DNA甲基化研究的深度也大大增加。一方面，通常的EWAS研究多以全血为研究对象，发现关联位点，这类研究通常将细胞组分作为协变量校正。然而很多研究报道了复杂疾病的DNA甲基化变异并非存在于血液中的多种细胞中，而是存在于一种或一类细胞里面，比如RA的表观遗传变异存在于单核细胞当中。研究人员将EWAS的研究范畴深入到细胞水平，发现很多DNA甲基化变异是发生在髓系中发生，少数在淋巴系中发生，这对于理解吸烟引起的表观遗传变异或者解释肺癌的发生有重要意义。
多个队列中的吸烟相关的甲基化变异存在于髓系来源的细胞中
另外一方面，细胞异质性对表观基因组数据是巨大的挑战，尽管EpiDISH等算法可以识别不同细胞类型、比例和细胞组分的差异，但很难为大量细胞和样本生成bulk组织样本提供可靠的单细胞水平的基因组DNA甲基化图谱。在单细胞甲基化检测技术还不能完美应用到各种组织时代，AndrewE.Teschendorf组开发的EPISCORE软件，通过bulk组织数据拟合单细胞RNA-seq数据，实现了对bulk组织表观遗传数据的单细胞分辨率的虚拟切割。尽管不同类型细胞的拟合度效果有差异，但仍具有极为重要的科研意义和应用价值。
EPISCORE的工作流程
那些贴近生活的各类文献
前面讲了许多高分大作，相信很多小伙伴们会有疑问，三期临床试验或者EWAS的大队列并没有贴近科研的生活圈，我们甚至想去模仿都显得过于奢侈。在这里，小编就来盘一盘，荐一荐IF10分的文献。
—Profile/LandScape类文献
顾名思义，LnadScape和Profile的文献主要通过甲基化维度展示研究疾病的整体概况，可以认为是疾病的肖像画。一般而言，这类以是否患病的DNA甲基化变异、疾病的发展/病变/治疗过程的DNA甲基化变化为研究目的，作为一项初步的探究，研究通常数十个样本的数量开展甲基化芯片检测，发现差异甲基化位点DMP、差异甲基化区域DMR、功能富集分析、互作网络分析，并展示特定基因的甲基化变异/变化。
这类文献在实验设计上并不会太复杂，但文章的上限较高。通常的文献会根据临床表型分组，根据上面列举的分析策略比较组间差异，深入文章还会借助一些其他分析手段，或结合临床信息、采样部位的细微差别讨论具体的临床问题，识别特异的甲基化位点/区域。
以下面这篇严重败血症的文献为例，目前缺乏败血症的表观遗传数据，研究人员比较了第一天进入重症监护室中败血症（n=66）和非败血症（n=68）的的甲基化差异。研究分析了DMP、DMR、富集分析，并着重讨论了IFN调控相关基因和特定DMR，并借助数据库的RNA数据验证甲基化结果。总的来说这篇文献并没有太多绚丽的分析，例样本的投入和首次开展败血症的表观遗传研究，IF=7.实至名归。
另外一篇文章是血管肉瘤的DNA甲基化谱分析。对于罕见的血管肉瘤（AS），其临床表现是非常不同的，研究人员通过对36个原发性AS的FFPE样本进行甲基化分析，通过无监督聚类将其分为4个亚组，并讨论各个亚组的染色体的稳定性以及生存情况。这篇文献目的明确，IF=8.，是一篇投入产出非常高文献。
—甲基化相关的功能验证文献
前面讲了很多甲基化芯片数据的高分文献，这些大多偏向于统计学分析和生物信息学分析。当我们拿到分析结果的时候，分析的结果往往会指向若干个甲基化位点，定位于某些特定基因上。这些位点或基因通常是用于解释疾病的发生发展，并通过查阅文献佐证。当然有时候基因没有文献报道，有时候根据我们的目标影响因子，或者根据个（lao）（ban）人的兴（ren）趣（wu）爱（fen）好（pei），就会开展相应的相关基因的功能验证了。那我们现在来聊一聊甲基化的功能验证应该怎么验证？
首先我们必须有一个结果：在临床样本的高通量筛选和细胞模型、动物模型里面，都有差异甲基化对应差异表达。如果缺表达数据或甲基化数据，用荧光定量或MSP一周内快速搞定。曾今有客户问小编，自己的实验发现只有差异甲基化没有差异表达应该怎么办，这个问题有点类似于“当炒一盘青椒肉丝的时候，手里只有青椒没有肉丝，应该怎么办？”小编想说，你手里有木有其他食材，咱换个菜试试？
然后我们得有2~3个目标分子。以两个层面为例，比如很多老师关心的miR的甲基化与miR的表达关系，miR抑制Gene表达，Gene表达与肿瘤细胞迁移、增殖，就可以形成一条故事线。
上面这篇文献（IF=5.）就很贴近生活：PTC中miR-a启动子甲基化→miR-a-3p下调；使用5aza或敲除DNMT3a使miR--a-3p表达恢复；功能研究表明miR--3p的抑制癌症迁移、侵袭、细胞生长；细胞模型中RAP2a促进肿瘤细胞迁移、侵袭、生长；小鼠模型miR--3p抑制小鼠肿瘤发展；
如果验证的元素增加到3个，比如miR启动子的特定区段的甲基化修饰也做到验证，影响因子就可以从5-6分的水平上升到8-9分的水平，下面这篇文章（IF=9.）这里主要用到了荧光素酶报告基因转染+5Aza处理+焦磷酸测序技术，完成功能验证。
这两年小编逐渐看到了在体外做甲基化功能验证的文献，大多上是在常规的miRNA、lncRNA调控基因表达，导致肿瘤细胞增殖、迁移的上游，增加了非编码RNA启动子受到甲基化抑制的功能验证实验，总的来说有一定工作量，但并不复杂。在这里，很多老师会疑惑为什么要做启动子区域，那其他区域怎么办呢？看了上面这两篇文献，相信各位老师也会有所感悟。在这里小编建议，优先做启动子的验证，尤其是因为种种原因不做甲基化功能验证的老师！
DNA甲基化作为表观遗传的重要领域，在分子标志物的应用上以及分子机理中，都有非常重要的意义。近几年的研究报道逐渐增多，里面有很多可以参考的优秀例子，也有很多空白等待我们去填补。期望这篇盘点能为您带来一些帮助，祝各位老师在新的一年里，顺顺利利，开开心心，健健康康，甜甜蜜蜜！~
中科普瑞专注于DNA甲基化，具有丰富的项目经验和分析经验，包括环境研究、多基因复杂疾病、遗传病以及肿瘤等多个研究方向，欢迎各位老师咨询合作！
撰文：晴天/本文系中科普瑞原创
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