锐帮读基于感染患者体液宏基因组测序快 [复制链接]

导读

在严重感染患者中，早期发现病原微生物对于指导临床干预和靶向性抗生素的治疗至关重要。然而，目前及时准确的诊断仍然是一个很大的挑战。感染诊断的失败或延误会导致住院和再入院时间的延长以及死亡率的增加。此外，未确诊的患者基本上均需要经验性广谱抗生素的治疗，增加了不良副作用和抗生素耐药性的风险。同时由于大多数感染综合征的临床表现难以区分，临床迫切需要准确、快速、全面的诊断方法。

而宏基因组测序能够同时从临床样本中检测几乎所有已知的病原体。目前，宏基因组测序应用于临床的研究已有很多，但是大多集中于单一的、一般不化脓的体液样本类型。近期，美国加州大学旧金山分校检验医学系CharlesY.Chiu?教授在《NatureMedicine》发表了对感染患者多种体液样本进行宏基因组测序分析并评估其诊断效能的研究，该研究利用两种测序平台（Illumina和OxfordNanopore）检测了例患者的份体液样本（从低细胞性脑脊液(CSF)到高人源DNA的脓液），并与传统微生物检测方法进行了比较。研究结果提示，mNGS检测用于诊断来自体液的未知感染，具有检测周期短同时阳性率高等优势，是一种很有前途的诊断工具。

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文献ID

英文题目：Rapidpathogendetectionbymetagenomicnext-generationsequencingofinfectedbodyfluids

中文题目：基于感染患者体液宏基因组测序快速鉴定病原体

发表期刊：NatureMedicine

见刊时间：年11月IF：36.13

发表单位：美国加州大学旧金山分校检验医学系CharlesY.Chiu?教授

材料与方法

共收集了名患者的份体液样本,包括25份脓肿样本、21份关节液样本、32份胸膜积液样本、27份腹膜积液样本、35份脑脊液、13份支气管肺泡灌洗液和29份其他体液。在份样本中，份用于评估基于Illumina平台mNGS检测的准确性（图1a）。

图1研究工作流程和样本分布

准确性比对样本包括个培养阳性(病原体属或种水平鉴定)，9个培养阴性但16S或28SITSPCR阳性和34个阴性对照，这些对照来自非感染性诊断(如癌症、创伤)的患者（图1b）。在用于评估准确性的个样本中，前87个连续收集的样本被用于比较Oxford纳米孔与Illumina测序的准确性。份样本中其余12份体液样本来自传统微生物检测阴性但高度怀疑或已证实感染的患者，见下文病例系列部分(图1b、表2)。这12份体液样本被用于分析mNGS检测在未知感染病原体检测中的诊断效用。阴性对照(混合的供体血浆基质)和阳性对照(供体血浆基质中加入已知数量的DNA，这些DNA来自被认为对人类没有致病性的生物体)与体液样本并行运行。

表2传统微生物检测阴性但高度怀疑或已证实感染的患者的病例系列

该研究开发了一种双重标签mNGS检测方法，该方法在纳米孔测序平台和Illumina测序平台上交叉兼容，适用于所有的体液，同时使用的是临床微生物实验室的液体自动化处理工作站。不同样本加入DNA的量有所浮动，从大约pg/ml的低细胞性液体（如CSF）到ug/ml的化脓性液体。Illumina和nanopore测序的读取深度中值为7.2M和1.1M。利用超高速病原体识别(SURPI+)软件对Illumina平台测序数据进行宏基因组分析以鉴定病原体。纳米孔测序每小时平均产生1Mreads，并使用SURPIreal-time(SURPIrt)软件进行实时数据分析。SURPIreal-time(SURPIrt)软件是内部新开发的生物信息学分析软件，用于从宏基因组纳米孔测序数据中分析鉴定病原体。纳米孔测序检测病原体的平均时间是50分钟，加上文库构建的5个小时，从收到样本到出具报告的检测周期为6个小时。而Illumina测序的检测周期约24h。在纳米孔平台上检测病原体的时间与体液类型无关(图1a)，但与根据每百万读数(RPM)估算的病原体DNA滴度呈负相关。

研究成果

1、研究的患者

在名患者中，有临床资料的患者有名，其中名(91%)为住院患者，包括61名(39%)需要重症监护管理的患者，45名(28%)符合败血症临床标准的患者，51名(32%)免疫功能低下患者（由于器官移植、近期化疗、人体免疫缺陷病*感染或药物诱导的免疫抑制而导致）。其中71(45%)名患者在采集体液时使用了抗生素。对份体液分别进行了细菌培养，其中63(35%)份和81(45%)份样本另外分别进行了抗酸杆菌(AFB)和真菌培养。

2、mNGS检测准确性

准确性评估主要是通过mNGS检测结果与金标准培养和/或病原检测的PCR检测结果进行比对（图1a）。对于细菌病原检测，采用两种参考标准进行评价：一个是临床金标准，包括培养和16SPCR结果。另一个是复合标准，与其他检测结果比对：

(1)对同一患者同时采集的其他样本类型进行正交临床试验；

(2)基于验证性研究的数字PCR(dPCR)试验；

(3)由传染病专家和临床病理学家独立作出裁决。

通过整合所有的信息来源，包括纵向患者图表回顾和dPCR检测，在获得mNGS结果后进行裁定(图1a)。

临床样本随机分为训练集(43个样本，36个细菌，8个真菌)和验证集(个样本，85个细菌，32个真菌)进行Illumina测序；以及用于纳米孔测序的训练集（n=42个样本，34个细菌和7个真菌）和验证集（n=43个样本，43个细菌和11个真菌）。在训练集ROC曲线得出的最佳Youden’s指数下，基于临床金标准验证集的mNGS检测结果显示：Illumina测序细菌检测的敏感性和特异性为79.2%和90.6%，纳米孔测序细菌检测的敏感性和特异性为75.0%和81.4%（图2c）。当使用复合标准验证时，Illumina测序的阳性符合率与阴性符合率分别为80.0%和95.3%，纳米孔测序的阳性符合率与阴性符合率分别为81.0%和93.0%（图2c）。在不同体液类型中（除血浆外），mNGS检测性能总体上是相当的(图2d)，其中，CSF检测的准确性最高。纳米孔测序与Illumina测序获得的nPRM是相近的(图2e)。

图2体液样品中mNGS检测的准确性及相关病原体载量

在34份培养和16SPCR均为阴性的阴性对照样本中，只有1份样本mNGS的检测结果为假阳性(痤疮丙酸杆菌)，因该细菌nRPM数值在检测阈值以上而报为阳性。在阴性对照样本中，其他来自背景污染生物体的读数低于检测阈值。另外，通过Illumina和nanopore测序，还分别在44%(16个中的7个)和20%(10个中的2个)阳性对照样本中检测出了人体共生菌，这些细菌被认为mNGS假阳性。在这些假定的假阳性病例中，共生菌的读数样品中微生物总读数的5%。

在使用复合阈值的训练和验证集的假阴性病例中，最常见的漏检微生物是金*色葡萄球菌。Illumina测序漏检了40例金*色葡萄球菌中的10例(25%)，但与遗漏的其他细菌感染病例相比，无统计学意义。纳米孔测序漏检了26例金*色葡萄球菌中的10例(38.5%)，与其他细菌漏检病例相比有统计学意义。

mNGS真菌病原检测准确性评估，采用培养和28S-ITSPCR结果组成的临床金标准进行比对。平均而言，根据nRPM计数，真菌DNA的浓度明显低于细菌DNA(P=0.)(图2f)。在训练集ROC曲线得出的最佳Youden’s指数下，基于独立验证集的mNGS检测结果显示：Illumina测序真菌检测的灵敏度和特异性分别为90.6%和89.0%，纳米孔测序真菌检测的敏感性和特异性为90.9%和%（图2c）。在训练集和验证集的假阴性病例中，Illumina测序和纳米孔测序分别在57%(4/7)和17%(1/6)的样本中检测到至少一个读数的真菌病原体。这表明，在测序深度更大的情况下，敏感性可能会得到提高。Illumina测序中大部分假阳性真菌(11of14,79%)的读数样品中微生物总读数的5%。

3、检测限(LoD)和线性关系

我们将4种对人类非致病性微生物(Streptococcusuberis,Rhodobactersphaeroides,Millerozymafarinosa，Aspergillusoryzae)的DNA加入健康供体血浆中，用于检测限（LoD）评估。将样品进行四倍稀释，范围从1:1(不稀释)到1:，每个稀释梯度重复4次。结果显示，mNGS检测方法的最低检测限为：细菌为-基因组当量（GE）/ml,真菌则为4基因组当量（GE）/ml。mNGS测得的微生物含量(GE/ml)与nRPM值呈很强的线性相关。

4、病例系列

为了评估体液mNGS在诊断感染方面的潜在临床应用价值，我们选择了12例在体液培养和/或PCR检测为阴性的情况下仍有临床可能或已确定感染的患者(表2)。分别有8例和3例通过直接从不同的体液/组织检测或血清学/化学检测作出了感染诊断，以及一例肠穿孔疑似腹部感染患者。在12例病例中，mNGS检测出7例疑似致病菌(表2)。另外2例由血清学诊断的梅*和球孢子菌的病例，mNGS检测到的reads水平低于预先确定的nRPM报告阈值，因而没有报为阳性。剩下的3例包括胸膜液样本中的新型隐球菌（BAL培养阳性）、胸膜液样本中结核分枝杆菌(淋巴结培养阳性)、脑脊液中的孢子丝菌（血清和CSFIgM抗体阳性），mNGS检测结果为阴性，可能是由于病原体载量低或人源背景高导致的。

5、mNGS与细菌16S和真菌28S的PCR比较

我们对14例已进行了16S或28SITSPCR检测的患者，同时进行了mNGS以评估其效能。14例病例中，有8例mNGS检测和PCR检测结果一致(图3a,b,d)。6例不一致病例中，5例仅mNGS检测阳性，1例仅16SPCR检测阳性。第一个不一致的细菌病例是一个患有坏死性肺炎免疫缺陷儿童病例，胸膜液的16SPCR检测为轻型链球菌属的，而mNGS检测检测为肺炎克雷伯菌(图3c)。mNGS检测结果通过以下五种方法得到正交验证：

(1)提取DNA的dPCR；

(2)测序文库的dPCR；

(3)提取DNA的扩增子PCR并进行Sanger测序；

(4)对侧胸膜液的mNGS(Illumina)测序；

(5)对侧胸膜液的dPCR。

第二个病例，尽管脑脊液培养和16SPCR都是阴性的，随后对神经手术中切除的深部脑刺激器(DBS)样本进行培养，结果显示K.aerogenes阳性(图3c)。脑脊液的mNGS检测结果中K.aerogenes也呈阳性，这一结果经dPCR正交验证。第三例为脓肿液，其16SPCR检测结果为鸟分枝杆菌复合物阳性，而mNGS检测为阴性。在三个所有不一致的真菌病例中，体液mNGS都能找到致病微生物，而真菌28SITSPCR检测为阴性(图3d)。通过相同的体液培养(n=1)、24d后的培养(n=1)或脑活检组织检测(n=1)临床证实了致病生物。

图3mNGS与16S(细菌)或28S-ITS(真菌)PCR的比较

6、体液和血浆mNGS的诊断阳性率的比较

在我们的研究中，7名患者共有9种病原体，他们有成对的体液和血浆样本可供比较mNGS检测。基于nRPM的病原体cfDNA载量在同一患者局部体液中比血浆中高倍(图4)。

图4成对体液和血浆标本中相对病原体载量的比较

7、厌氧细菌和病*的检测

厌氧菌不包括在准确性评估中，因为厌氧培养并不总是进行，培养的厌氧菌通常没有物种划分。然而，在准确性评估中，一个厌氧菌培养阳性的样本(来自软组织脓肿的大孔菌，病例S87)通过mNGS检测成功。应用先前验证的三个不重叠序列的临床mNGS阈值进行病*检测，从Anelloviridae(n=5)、Herpesviridae(n=9)和Adenoviridae家族中检测到16个病*。在5个检测到anellovirus的患者中，有4个（80%）为自免疫功能低下的患者，这与该人群中anellovirus作为活动性炎症的非致病性标记的报道相一致。在体液mNGS检测到的剩余11个病*中，6个病*经病*特异性PCR正交证实为真阳性病例。

研究结论

本研究采用了一种基于无偏倚宏基因组测序方法，从多种体液中快速鉴定病原体。其中主要的创新点为：

(1)广泛样本类型的检测；

(2)兼容的输入不同浓度cfDNA，可相差6个数量级(pg/ml-ug/ml)；

(3)两用条码系统在Illumina和纳米孔测序平台兼容；

(4)经临床验证的生物信息学软件，可用于自动分析和解释mNGS数据。

体液mNGS的潜在用途在于：12例体液培养和/或PCR检测为阴性的样本，mNGS在7例中鉴定到病原体，同时还在另外2例中鉴定到低于报阳阈值的病原体(表2)。

在本研究中，mNGS检测漏检了金*色葡萄球菌，但仅纳米孔测序的漏检具有统计学意义。研究人员认为纳米孔测序检测金*色葡萄球菌的低灵敏度归因于较高水平的人类宿主背景DNA。值得注意的是，漏检金*色葡萄球菌的体液中白细胞(WBC)计数为×/L，比其他微生物的白细胞中值增加约倍。导致纳米孔测序灵敏度降低的其他因素可能是本研究中读取深度较低，以及与Illumina测序相比，其测序错误率较高。这些限制可能只有通过提高每个样本的平均测序通量或随着时间的推移不断提高纳米孔的读取精度来解决。

该研究的方案是从体液的上清中寻找特异性cfDNA序列。而其他研究有的使用去除宿主的方法，如差异裂解法，从高人源DNA背景样本(如呼吸道样本或关节液)中富集完整的病原体DNA。然而，由于含有病原体cfDNA的上清在差异裂解过程中被去除，这种富集方法可能不适用于低细胞样本，如血浆和脑脊液。差异裂解还会影响其他微生物的检测，如病*和寄生虫。此外，这些方法需要裂解和离心多步，增加了方法的复杂性，延长了检测周期。另外，该研究方法也不使用机械处理步骤如玻璃珠击打，玻璃珠击打可以提高对真菌和一些含有刚性细胞壁的细菌的检测，但在临床实验室的日常使用较为费力，并且可能会导致人体DNA释放增加宿主背景，降低检测灵敏度。

血液中病原菌cfDNA分析已用于诊断深部感染。然而，细菌DNA通常在血液中含量较低。该研究显示感染部位附近体液中病原体cfDNA的含量比血液中的高出倍。体液中较高水平的病原体cfDNA可以提高分析灵敏度，降低准确检测所需的测序深度，从而降低检测成本。此外，从体液中直接识别病原体可以定位感染源，这对指导针对性的管理和治疗至关重要。

该研究的局限性包括以下几点。首先，每种体液类型的检测数量有限，最常见的体液类型检测数量从13-35份不等。其次，临床样本的测序深度不同，这可能导致了一些假阴性结果。第三，细菌16SPCR或真菌28SITSPCR等正交试验并没有对所有样本进行。第四，没有建立背景微生物数据库，因此可能会降低检测的特异性。第五，阳性对照体液来自于完成其他临床检测后的残余样本。

亮点

开发了一种宏基因组检测方法，利用体液中的游离DNA（cfDNA）来识别病原体。与传统检测方法比对，评估了基于两种测序平台（Illumina测序平台和纳米孔测序平台）的mNGS检测在感染患者多种类型体液中的诊断效能。

关于锐翌

上海锐翌生物科技有限公司成立于年，总部位于上海市浦江高科技园，已在杭州、青岛、北京等地成立区域中心，是一家专业从事基因科技及健康服务的国家高新技术企业。锐翌生物依托高通量测序技术平台，专注于人体微生物组前沿技术和研究成果在基础科研领域的突破，以及在医学上的转化应用，助力高等院校、医院的科研工作者多角度、全面地探究和解决科学问题，助力更多优质科研成果发表。同时，在大肠癌早筛早诊、感染微生物宏基因组检测等精准医疗领域开发检测技术及应用方案，致力于为医疗机构提供疾病早期检测和健康综合管理服务，目前已和全国医院达成深度合作。

锐翌生物研发的“新型冠状病*（-nCoV）核酸检测试剂盒（可逆末端终止测序法）”、“新型冠状病*（-nCoV）核酸检测试剂盒（RT-PCR法）”、“一次性使用病*采样管”均已获得欧盟CE认证。公司先后荣获国家高新技术企业、上海闵行十大科技创业新锐企业、上海最具投资潜力50佳创业企业、上海市专精特新中小企业、上海市科技小巨人（培育）企业等多项荣誉称号。锐翌生物始终秉承“锐意进取”的理念，不断为健康创造美丽，为生命创造奇迹，为人类践行梦想！

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