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胶体金免疫层析技术在疾病诊断中的应用

康奕，张文慧，张林波

关键词：胶体金；抗原检测；抗体检测；核酸检测

文章编号：—()04——04

摘要：胶体金免疫层析技术是一种应用抗原抗体特异性反应建立起来的新型免疫检测技术，因其具有方便、快捷、廉价、易保存等优点日益受到人们的重视，并在人类、动物和植物的疫病检测中广泛加以应用。本文简要介绍胶体金免疫层析技术的基本原理及其在抗原、抗体及核酸检测方面的应用，并对其存在的问题及发展前景进行分析，为该技术的深入研究与进一步应用奠定基础。

胶体金免疫层析技术(goldimmunochromatogra—phyassay，GICA)是在20世纪80年代初期出现的将色谱层析技术和免疫技术相结合的一种体外快速检测技术，作为即时检验(pointofcaretesting，POCT)方法中的一种，目前广泛应用于畜禽传染病诊断、妊娠检测及食品安全等多个研究领域。其具有方便、快捷、廉价、易保存等特点。日益受到人们的重视，具有广大的应用空间和发展潜力。

胶体金免疫层析技术的基本原理

胶体金免疫层析技术是以硝酸纤维素膜为固相载体，胶体金为标记物，通过抗原抗体特异性反应建立起来的一种新型诊断技术。胶体金免疫层析试纸条的构造如图1所示：试纸条由7部分构成，包括样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、测试线、控制线、吸水垫和PVC底板。其基本原理为：该技术所采用的氯金酸水溶液可以在还原剂如抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸、白磷等作用下聚合成特定大小均匀分布的颗粒(称为胶体金)，并且因颗粒大小不同而成不同颜色。在等电点偏碱的环境中胶体金可与蛋白质借静电引力形成牢固的结合，除蛋白质分子外，胶体金颗粒还可以与其他物质如DNA、酶及一些功能高分子结合。将与蛋白(抗体或抗原)偶联的胶体金涂于胶体金垫上，硝酸纤维素膜上固定特异的抗体或抗原。阳性样品滴加到样品垫后，由于毛细作用向前移动，并与胶体金垫上的复合物结合，当其移动到检测线处时，与检测线上包被的特异性抗体(抗原)结合使胶体金滞留而显色。胶体金免疫层析法主要分为双抗体夹心法、间接法和竞争法。所针对的检测对象有抗原、抗体或者核酸。目前应用胶体金免疫层析技术检测抗原、抗体已很成熟，而应用于核酸的检测较少，但近期研究发现，以特定核酸为检测对象，与传统的琼脂糖凝胶电泳相比敏感性高、速度快，有望进一步开发和利用。

胶体金免疫层析法在抗原检测中的应用

抗原是能刺激机体产生特异性免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应的物质。胶体金免疫层析法检测抗原主要应用双抗体夹心法，由于抗原表面存在不同的抗原决定簇，故可用于与之对应的不同抗体进行检测。该技术在动植物疾病及人类部分疫病诊断方面已有广泛的应用。

在动物疫病检测方面，Li等建立了检测猪繁殖与呼吸综合征病*(PRRSV)的免疫层析法。该法使用抗PRRSVN蛋白不同抗原表位的单克隆抗体2D7和IG7，将单克隆抗体2D7与胶体金结合，1G7作为检测线，山羊抗鼠IgG作为控制线。试验结果证明PRRSV最低检测量为2.9×TCID50／mL。Paisam等使用白斑综合征病*囊膜蛋白VP28特异性单克隆抗体(W1，W30)和*头病*P20单克隆抗体(Y19，Y20)开发出一种双重免疫层析试纸条，可同时快速检测对虾白斑综合征病*和*头病*感染。该方法将单克隆抗体W30和Y19与胶体金结合，作为胶体金垫，单克隆抗体W1和Y21涂布于硝酸纤维素膜上作为检测线w和Y，羊抗鼠IgG作为控制线。试纸条以虾足为样本进行评价。如果患白斑综合症病*或*头病*则会在相应的w或Y线显色。C线用于检测试纸条有效性。Meng等建立检测猪血清中猪附红细胞体的胶体金免疫层析法。该法利用大肠杆菌中表达的重组MSG1免疫BALB／c小鼠产生多克隆抗体。多克隆抗体作为检测线。免疫层析法检测下限为μmg／mL，并与其他相关的猪病原体无交叉反应。

在植物疾病诊断方面，Kusano等建立了检测柑橘中苹果茎沟病*(ASGV)的快速免疫层析法。它通过用重组苹果茎沟病*外壳蛋白作为抗原进行免疫获得9株单克隆抗体。根据竞争结合ELISA试验结果将其分为2组，选择A组的4A12与胶体金共轭，B组的6n31作为测试线。该试纸条可将柑橘样品稀释到1：进行检测。

在人类疾病的诊断中，胶体金免疫层析技术也有广泛的应用。血液中17α-羟孕酮浓度增高是先天性肾上腺皮质增生症的标志。Tripathi等建立竞争法测量血清中17α-羟孕酮的快速免疫层析法。由于17α-羟孕酮无免疫原性且不易与胶体金结合，故用共轭的17α-羟孕酮-3-羧甲基-牛血清白蛋(17一ohp一3一cmo—bsa)吸附于制备的胶体金表面。该试纸条的灵敏度为2.5μg／L。Ji等开发检测甲型H1N1流感pdm09的免疫层析试纸条。该法使用单克隆抗体d38、3i38分别与胶体金共轭和作为检测线。与红细胞凝集反应相比，试纸条最低检测量为1／2血凝单位，与实时逆转录聚合酶链反应相比，该试验的敏感性和特异性分别为75.86％(／)和％(43／43)。

胶体金免疫层析技术在抗体检测中的应用

当体内抗原含量较少不能满足检测所需时就可以利用抗体进行检测。胶体金免疫层析法检测抗体主要采用间接法，如程婷婷等建立胶体金免疫层析法快速检测布鲁氏菌抗体，将金*色葡萄球菌A蛋白(SPA)作为胶体金标记物，2条检测线分别为OMP31与BP26，因牛布鲁氏菌缺乏表达OMP31的基因，故可区分牛、羊布鲁氏菌病感染。且该试纸条不与其他相关疾病感染血清反应，特异性高。Li等利用基因工程方法将猪瘟病*Erns和E2基因主要抗原域融合表达获得嵌合蛋白CnC2。将CnC2抗原与胶体金偶联涂于胶体金垫上，金*色葡萄球菌A蛋白和抗CnC2单克隆抗体固定于硝酸纤维素膜上分别作为检测线和控制线。该试纸条的敏感性和特异性分别为97.0％和％，其结果与ELISA相比具有93.50％的一致性。Mdluli等开发胶体金免疫层析试纸条半定量检测人血液中的结核分枝杆菌(MTB)38ku抗体。当血液中的样品浓度增加时，检测线的深度增加而控制线逐渐变浅。将38ku抗体的浓度从0-ng／mL放人检测孔，并观测检测线和控制线的深度，实现结核分枝杆菌抗体的半定量检测。Yang等建立检测猪口蹄疫病*O型抗体的胶体金免疫层析法。使用口蹄疫病*的主要保护性抗原VPl与胶体金结合，葡萄球菌A蛋白和抗口蹄疫病*抗体固定于硝酸纤维素膜上分别作为检测线和控制线，并以份猪血清为样本进行评估，结果与ELISA方法相比具有98％(／)的相似性，检测试纸条的特异性为99.1％，可以在4℃下保存12个月且敏感性不变。

应用胶体金免疫层析法检测抗体也可以使用竞争法，如Fu等建立检测猪血清中旋毛虫抗体的胶体金免疫层析法。将旋毛虫幼虫的排泄分泌抗原与胶体金偶联，兔抗猪IgG和抗分泌排泄抗体分别作为检测线和控制线。样本为注入、0、00个旋毛虫幼虫不同感染时间的猪血清，结果表明该方法可以分别检测出3种感染量感染21、28和35d的血清，并且与ELISA的相似度很高。

胶体金免疫层析法在核酸检测中的应用

核酸检测在现代生活中发挥着越来越重要的作用，它可以在疾病发展的早期进行诊断，为其治疗节省了宝贵的时间。胶体金免疫层析技术检测核酸需要预先提取病料中的基因组，再使用特异性引物进行PCR，以PCR产物为样本进行检测。伴随着科技的日益发展，可以将PCR技术、多重PCR技术及环介导等温扩增技术与胶体金免疫层析法相结合，对病原体的核酸进行诊断。

杨贤等建立一种检测乙型肝炎病*核酸的方法。该法利用聚合酶链反应扩增乙肝病*的保守区，并对其上、下游引物的5’端分别修饰异硫氰酸荧光素和生物素。将标记有链霉亲和素的胶体金复合物作为胶体金垫，检测线处固定抗异硫氰酸荧光素抗体。用收集到的15例阴性样本及33例阳性样本进行检测，并与实时荧光PCR的结果进行了比较。结果显示该试纸条检测乙肝病*核酸的灵敏度为cop-ies／mL，特异性为％。阪崎肠杆菌可诱发新生儿和婴儿严重的脑膜炎和败血症，死亡率高。Blazkova等建立检测阪崎肠杆菌核酸的胶体金免疫层析试纸条。选取阪崎肠杆菌特异的16SrRNA基因设计引物，并标记。该法的最低检测限度是8ngPCR产物。其结果不但与传统的微生物诊断方法一致，而且节省了大量时间。

多重PCR(multiplexPCR)是在一个PCR体系中加入2对或2对以上的引物，可以同时扩增出多个核酸片段心。将多重PCR技术与胶体金免疫层析法相结合可以对某一病原的不同类型加以区分，如Soo等应用结核分枝杆菌复合物特有的IS6基因片段和结核分枝杆菌特异基因RV，将多重PCR技术和胶体金免疫层析法相结合，对结核分枝杆菌复合物进行分型诊断。设计2对引物，RV上下游引物的5’端分别标记生物素和地高辛。IS6上下游引物的5’端分别标记荧光素和生物素。2条检测线T1、T2分别固定有抗地高辛单克隆抗体和抗荧光素单克隆抗体。Horng等将多重PCR技术和免疫层析法相结合检测冷水塔中的*团杆菌。该法使用*团杆菌属特异的16SrDNA和嗜肺性*团杆菌特异的dnaLI，首先运用多重PCR，再用免疫层析试纸条检测。2条测试线T1、T2分别固定有抗地高辛单克隆抗体和抗荧光素单克隆抗体。T1出现条带说明含有*团杆菌，他出现条带进一步表明该菌为嗜肺性*团杆菌。以水塔中的水样为样本进行检测，与传统的培养、生化和血清学试验方法相比，*团杆菌敏感性为％，噬肺*团杆菌敏感性菌为96．6％，特异性为％。

环介导等温扩增(p—mediatedisothermalamplification，LAMP)技术是在等温环境下扩增核酸片段的一种方法，使用链置换型DNA聚合酶可在1h内实现倍扩增，特异性强、敏感性高。Soli-man等忙刊将环介导等温扩增技术和胶体金免疫层析技术结合，快速、灵敏检测Ⅲ型锦鲤疱疹病*(koiherpesvirus，KHV)。将生物素标记的LAMP产物与异硫氰酸荧光素标记的特异性探针杂交5min，样本滴人5min后会在检测线出现条带。核酸试纸条与传统的琼脂糖凝胶电泳相比具有相当的敏感性，但其速度很快。该方法可以简化诊断Ⅲ型锦鲤疱疹病*，具有很高的敏感性和特异性。

高效能的引物是胶体金免疫层析技术检测核酸的关键，由于该反应是基于引物上标记物与试纸条上检测线发生抗原抗体特异性反应建立起来的，为避免假阳性结果的产生，在引物设计过程中应避免引物间形成二聚体。

展望

胶体金免疫层析试纸条具有成本低廉、样品需求量低、便携、灵敏度高等特点，具有一定的商业价值，并且其适用的样本非常广泛，包括血液、体液、粪便、组织等，故可以开发出商业化的试纸条用于检测。胶体金免疫层析技术已经获得越来越多人的认可，在疾病诊断中的地位也日益彰显，但胶体金免疫层析技术也有一定的弊端，它只能实现定性检测和半定量检测，不能实现定量检测，结果重复性差，并且有的试纸条样品需要预处理，浪费时间，这些问题需要在日后的发展中加以克服。

参考文献：省略

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