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背景介绍
首先介绍几个概念：自噬是一种广泛存在于真核细胞的生命现象，具有吞噬病原体、调节炎症反应、减轻细胞凋亡、维持机体内环境稳态的作用。是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。自噬经历了：吞噬泡(phagophore)--自噬小体(autophagosome)--自噬溶酶体(autolysosome)三个过程。自噬影响多种细胞反应，如代谢平衡，细胞转归和炎症。在正常的生理反应或轻度压力下，自噬提供了一定程度的控制以促进生存，此时具有适应性。然而，在严重或慢性压力下，过度自噬活动或自噬不足可分别导致大量自身降解或有*物质的积累;这些结果中的任何一种都是适应不良的，最终可能导致细胞死亡。所以总结一句：自噬对机体不是单纯的保护或者损伤作用。常用的检查方法举例1）WesternBlot检测LC3利用WesternBlot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成。自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。
2）透射电镜下观察自噬体的形成：透射电镜下吞噬泡(phagophore)的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬小体(autophagosome)的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(autolysosome)的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。
3）测量自噬的降解产物——P62蛋白/SQSTM1蛋白P62是自噬降解产物的检查，P62是已知的的自噬蛋白，也称为SQSTM1蛋白，具有底物的特异性，其作为一种调节因子参与自噬体的构成，在自噬的中晚期被降解，所以在细胞内整体P62水平的表达与自噬活性存在负相关。而LC3是目前最明确的贯穿整个自噬过程，并能出现在晚期自噬溶酶体中的自噬相关蛋白。
P62蛋白是自噬激活的标记物，LC3II增加，说明了自噬小体的增加，如果P62同时减少的，说明自噬活性增强，如果P62同时增加，说明自噬小体降解过程抑制，即自噬过程下游被抑制。简单介绍一下脓*症是机体对感染的反应失调而引起的危及生命的器官功能障碍，临床发病率和死亡率较高。因此脓*症是重症监护病房死亡的主要原因。往往脓*症的研究都落脚在一个靶器官上，比较多的是如肺、肾脏等。本研究聚焦的是心脏。心脏功能障碍同样多器官衰竭的严重组成部分，而线粒体占了约30％的心肌体积，已经理论研究证明线粒体结构和功能的损伤，与线粒体活性氧的过量产生和线粒体衍生的机体损伤相关分子模式（DAMPs）的产生相关，在脓*症诱导心脏炎症和功能缺陷中起关键作用。
所以作者在研究机制上更聚焦线粒体的功能，探究脓*症如何影响线粒体信号传导，从而进一步导致心脏功能障碍。线粒体的质量和数量受到严格调节。功能失调的线粒体可以通过自噬进行分离和消除，这是一种依托溶酶体去除受损蛋白质和细胞器的过程。介绍完了脓*症和自噬，下面来讲讲他们的关系问题。
前期已有临床和基础研究表明，脓*症会引起多个器官（包括心脏）的自噬（此处省略大量文献）。然而，我们目前对自噬在脓*症发病机制中的作用的理解仍然存在有限且不确定，总结即有保护作用也有损伤作用。
如分别使用体内（小鼠盲肠结扎穿孔制造脓*症模型）和体外实验（使用脂多糖（LPS）培养的心肌细胞），获得的证据都表明通过刺激自噬可以起到保护心肌的作用，从而提供自噬是适应性反应的证据。
相反，最近的一篇文章表明，在LPS诱导的脓*症小鼠模型中，使用自噬抑制剂或抗氧化剂减少自噬可以改善心肌收缩性，从而支持自噬不适应的结论。作者认为这些观察结果的差异可能是由于实验环境的差异，其中脓*症的严重程度，药物特异性和作用时间不同。Beclin-1，在自噬起始过程中通过与磷脂酰肌醇激酶的相互作用发挥作用，这种蛋白质复合物一起启动自噬的成核步骤以开始自噬通量，并且还参与后续步骤，涉及自噬体与溶酶体的融合。简单理解就是：Beclin-1很重要，刚刚前面自噬的三个阶段也讲过了，吞噬泡--自噬小体--自噬溶酶体，Beclin-1是形成自噬体的必需分子，主要是提供分子反应的“平台”，可以介导多种自噬相关蛋白定位于吞噬泡，并与多种蛋白反应调控自噬体的形成与成熟。这篇文章主要旨在解决自噬通量如何随脓*症严重程度的变化而变化，并确定Beclin-1在脓*心脏损伤中激活自噬反应的保护作用。
使用的模型是由LPS（脂多糖）诱导的脓*症的小鼠模型，还使用了转基因小鼠：具有心脏特异性过表达Beclin-1（Becn1-Tg）和单倍体缺失Beclin-1基因的（Becn1+/-），相当于Beclin-1的过表达和敲低两种情况。
还有就是Beclin-1通过线粒体自噬的作用，在调控线粒体功能方面的作用以线粒体是通过自噬选择性降解线粒体的过程。最后回归临床应用前景——评估使用衍生的Beclin-1的新肽在药理学上诱导自噬的治疗作用。结果共分6个部分1、LPS诱导脓*症心脏损伤自噬通量的剂量依赖性变化
给小鼠腹膜内（IP）注射LPS（0.25-15mg/kg）,假手术组是注射PBS。造模后18小时收获心脏组织,然后开始分析测量相关指标。通过Western印迹检查LC3II，自噬体形成的标志物。与假手术相比，LPS诱导动物的LC3II水平更高（图1A）。值得注意的是，LC3II在低剂量LPS（0.25-2.5mg/kg）的作用下呈剂量依赖性增加，但随后对较高剂量（5-15mg/kg）的反应逐渐下降。与自噬增加相一致，p62/SQSTM1在自噬过程中呈现相反的趋势，说明自噬活性增强。LPS对Beclin-1水平有适度影响。这些数据表明LPS刺激心脏自噬的剂量依赖性变化。
一般做自噬可能主要就是检查一些特异性指标
作者为了将自噬过程丰富，进一步研究了自噬通量，什么意思呢？自噬过程是动态变化的，而自噬体仅是整个自噬通路过程中的一个中间结构．要说明细胞自噬活性的强弱，必须通观整个自噬的过程是否顺利，即通过基于自噬性降解的自噬通量(autophagicflux)分析来进一步说明自噬活性．自噬通量是一个动态连续的概念，涵盖了自噬体的形成、自噬性底物向溶酶体的运送以及在溶酶体内降解的整个过程．显然，对这整个过程进行监测较单纯自噬体检测更能反映自噬活性，因此“自噬通量”分析是反映自噬活性的可靠指标．
为了证实LC3II的这种趋势代表自噬的激活而不是自噬体成熟的阻断，用巴弗洛霉素A1处理小鼠，巴弗洛霉素A1是阻断自噬体与溶酶体融合的抑制剂。正，结果显示，巴弗洛霉素A1在术和LPS诱导的动物心脏组织中，引起LC3II和p62的显着积累。
综上P62的结果表明LPS诱导的LC3II增加不是因为自噬通量的下游抑制（图1B）。这些数据表明临床意义在于：LPS诱导的心脏中存在剂量依赖性自噬通量。该反应包括两个阶段：当LPS剂量低时稳态增加，模拟不太严重或轻度脓*症，并且当LPS剂量高时逐渐下降，类似于严重脓*症期间的事件。
2、Beclin-1水平变化对LPS诱导的脓*症中心脏mTOR雷帕霉素信号的自噬反应
为了检查脓*症后自噬在心脏功能障碍中的作用，作者先验证了在α-肌球蛋白重链启动子（Becn1-Tg）下具有心脏特异性过表达Beclin-1或对于beclin1具有单倍体不足的小鼠品系（Becn1+/-）。在基线时，野生型（WT），Becn1-Tg和Becn1+/-小鼠难以区分并且显示出相似水平的身体活动。如所预期的，在Becn1+/-小鼠的心脏中Beclin-1水平低于WT，但在Becn1-Tg中更高（图2A）。说明过表达和敲低的转基因小鼠构建是成功的，也是后面一直用的两组。
用LPS处理小鼠，与WT相比，在Becn1-Tg中LC3II的水平更高，同时观察到p62的降解更强，说明Becn1-Tg小鼠中自噬通量的增加（图2B）。相反，这些在Becn1+/-动物心脏中的反应显着减弱。
下面肯定要做自噬的相关机制了
哺乳动物靶标雷帕霉素的激酶（mTOR）是抑制Beclin1依赖性自噬活性的关键调节点，也是就是和自噬通量负相关。
先是该通路的下游
mTOR介导的信号转导作用于下游效应物，如4E-BP1和S6激酶，启动相关基因转录和翻译，从而调控自噬，因此检查S6K的磷酸化水平来研究有无激活mTOR通路。
先看LPS的作用，就是WT组和Sham组对比，检测了mTOR及其下游因子的激活，4E-BP1和S6激酶。发现较高剂量的LPS（包括5和10mg/kg）显着增加所有3种效应子的磷酸化（图2C），表明WT心脏中mTOR信号传导的激活。然而，在较低剂量的LPS，2.5mg/kg，之前已经证明自噬是最强大的，LPS对mTOR及其下游因子的磷酸化几乎没有影响。这些结果显示mTOR信号传导的激活，与更高LPS剂量的诱导心脏自噬的下降之间的相关性。
再看Becn1-Tg和Becn1+/-组
在与Becn1-Tg的心脏中mTOR的活化显着减弱，但与WT相比在Becn1+/-小鼠中更强（图2C）。因此，mTOR的活化与自噬活性呈负相关，同时表明增强Beclin-1信号转导可抑制mTOR活化，从而即使在严重脓*症的情况下也能维持自噬。
下面做的是mTOR信号通路的上游
相关研究表明，哺乳动物体内线粒体自噬的调控主要由PTEN诱导激酶1(Pink1)/E3泛素连接酶Parkin、Nix/BNIP3、Mieap、FUN14结构域包含蛋白1(FUNDC1)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、UNC-51样激酶1(ULK1)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)等蛋白介导
因此，比较了这些小鼠心脏中AMP活化蛋白激酶（AMPK）和Unc-51样自噬激活激酶1（ULK1）的信号。这两种激酶的活性位点的磷酸化水平在Becn1Tg中显着更高，但在Becn1+/-小鼠中更低（图2D），表明Beclin-1通过增强AMPK和ULK1涉及自噬的正反馈调节。
3、过表达Beclin-1可改善LPS诱导的脓*症的心脏结局
在假手术和LPS诱导的WT组，Becn1-Tg和Becn1+/小鼠中通过超声心动图检查心脏表现。在WT小鼠中LPS诱导后18小时，≥5mg/kg的LPS诱导显着减少了缩短分数（图3A），说明心功能下降了。然而，较低剂量的2.5mg/kgLPS就已经影响了Becn1+/-的心脏功能老鼠。相反，只有最高剂量，10mg/kgLPS，减少了Becn1-Tg小鼠的缩短分数。随着观察到的Becn1-Tg小鼠心脏功能的保持，这些结果表明Beclin-1依赖性自噬是对心脏败血症的适应性保护性反应。
为了把Becn1-Tg对心功能的保护作用做充分，还检测了其他指标。
作为额外的损伤指标，检查了WT，Becn1-Tg和Becn1+/-小鼠的心脏组织中的细胞因子水平（图3B）。
与文献一致，LPS剂量依赖性地增加心脏中的炎性细胞因子，而且脓*症本身就和炎症相关。
这边补充一部分背景知识：脓*症发病机制复杂，涉及机体多个器官。目前，机体失控性炎症反应学说，被认为是脓*症发病机制的重要基础，即脓*症早期释放促炎和抗炎两大类细胞因子，促炎和抗炎作用的失衡将会启动炎症级联反应，进一步造成炎症反应的平衡失调，因此炎症反应平衡失调一直是脓*症发生发展机制的研究重点。自噬是一种广泛存在于真核细胞的生命现象，具有吞噬病原体、调节炎症反应、减轻细胞凋亡、维持机体内环境稳态的作用。随着研究的深入，自噬常作为维持促炎因子和抗炎因子之间平衡的重要调节机制。
Beclin-1的过表达显着降低细胞因子水平，其中白细胞介素-6，白细胞介素-17α和干扰素-λ中的降低最多。在LPS诱导后，Beclin-1敲低组则导致细胞因子升高。
进一步通过免疫组织化学在WT，Becn1-Tg和Becn1+/-小鼠中检查髓过氧化物酶（中性粒细胞积聚的标志物）的含量，MPO被认为是的心血管早期损伤的标志物之一，体内MPO含量升高预示着有动脉硬化以及冠心病的风险，是心肌梗死的早期预警。
LPS刺激心脏中显着的中性粒细胞浸润，其在Becn1+/-中升高，但在Becn1-Tg小鼠中更不显着（图3C），相对于WT和Becn1+/-没那么高，也提示Becn1-Tg小鼠可以对心脏的适应性作用。
下面又做了纤维化
纤维化通常是炎症的结果。使用已知标记物，α-平滑肌肌动蛋白和胶原蛋白（这些都是纤维化的标志物）的沉积检查了WT，Becn1-Tg和Becn1+/小鼠的心脏纤维化。
LPS诱导WT心脏中α-平滑肌肌动蛋白的心脏含量逐渐增加。该反应在Becn1-Tg小鼠中显着降低，但在Becn1+/-小鼠中升高（图3D），说明Becn1-Tg对LPS导致的纤维化有一定的抑制作用。
用于检测心脏组织中的胶原的Masson三色染色在纤维化反应中显示出类似的模式（图3E）。这些数据与Beclin-1活性一致，保护心肌免于脓*症期间的纤维化损伤。现在作者已经把脓*症、Beclin-1基因、mTOR通路、心肌保护作用都联系起来了，下面就是联系一下细胞器——线粒体。
4、过表达Beclin-1可保持脓*症期间的心脏线粒体质量
之前有研究观察到脓*症损害线粒体结构并导致心脏线粒体功能缺陷。线粒体损伤的变化有线粒体肿胀、嵴消失、空泡化等，我也不是太会看，我以前是看里面的嵴和结构的完整性，我查了一下，心肌比较常见看：线粒体固缩：线粒体变小，基质变深，嵴紊乱有趋向融合者，功能上此种线粒体功能降低或丧失，最后将被清除。心力衰竭是心肌细胞内有多数线粒体固缩出现。此外在肝炎、饥饿状态、凝固性坏死组织及癌细胞内也常见，可能是由于基质的脱水所致。这幅图上看还是挺明显的，特别是高剂量，线粒体都变小固缩了。电子显微镜用于来自WT，Becn1-Tg和Becn1+/-小鼠的心脏左心室壁中的线粒体形态。在WT心脏中，LPS剂量的增加导致分离的，小的，圆形线粒体的频率的剂量依赖性增加和线粒体内膜的明确定义的嵴结构的丧失（图4A）。这些变化不太明显，需要更高剂量的LPS才能在Becn1-Tg小鼠中表现出来。相反，这些中断在Becn1+/-小鼠中更为严重。说明Becn1-Tg组相较于WT
Becn1+/-还是有线粒体保护作用的。当然光从图像上看还不行，肯定还需要定量，我查了一下衡量线粒体形态改变的指标主要是比表面积，是线粒体表面积和体积的比例，可用图像分析的方法得到这个结果，但作者没有用这个方法。
采用的测线粒体DNA（mtDNA）片段。
线粒体DNA（mtDNA）片段可以从受损的线粒体释放到细胞质或细胞外空间中，并且它们作为一种损伤相关分子模式（DAMP，损伤相关模式分子是组织或细胞受到损伤、缺氧、应激等因素刺激后释放到细胞间隙或血液循环中的一类物质,可通过Toll样受体、RIG-1样受体或NOD样受体等模式识别受体,诱导自身免疫或免疫耐受,）起到刺激炎症的作用。我们量化了LPS诱导后WT，Becn1-Tg和Becn1+/-小鼠心脏细胞质中游离mtDNA的水平。在WT心脏中存在剂量依赖性mtDNA释放，其在Becn1-Tg中被抑制但在Becn1+/-小鼠中被夸大（图4B）。
为了评估线粒体含量的变化，线粒体标志物多重检测评估了mtDNA编码的细胞色素c氧化酶I（COX1）和核DNA编码的电压依赖性阴离子选择性通道1（VDAC1）的蛋白质水平（图4C）。LPS引发这2种线粒体蛋白丰度的剂量依赖性降低，表明LPS诱导的心脏线粒体含量降低，这个本身也有研究证实过：肺炎相关脓*症模型也有线粒体损伤与清除。线粒体损失在Becn1-Tg小鼠中减轻，但在Becn1+/-小鼠中加重。
类似地，线粒体功能的测定，以复合物I和复合物II-III活性测量（线粒体呼吸链复合物I(NADH氧化酶)、线粒体呼吸链复合物II（琥珀酸脱氢酶）是电子进入线粒体电子传递链（ETC）的主要元素。所以测他们的活性可以很好的反应线粒体的功能），在5mg/kg的LPS诱导后，与WT小鼠相比，在Becn1-Tg小鼠中保存得更好，该剂量明显导致WT的心脏功能障碍，但Becn1-Tg组小鼠没有（图4D）。基于电子显微镜图像的组间线粒体质量的比较另外证实了这些结果（图4E）。（这个我也不太清楚，为什么这幅图定量了，和A的电镜图有什么区别）
这是作者已经把现在作者已经把脓*症、Beclin-1基因、mTOR通路、心肌保护作用、还有线粒体都联系起来了，下面就是联系线粒体自噬了。
5、过表达Beclin-1通过PINK1-Parkin通路调节线粒体自噬。
与线粒体相关的LC3II和PTEN诱导的推定激酶1-Parkin途径的因子但抑制LPS后线粒体受体的增加PINK1-Parkin通路的作用，该通路可以调控线粒体的自噬。
PINK1(PTENinducedputativekinase1)是一种蛋白激酶。能在整个身体的细胞里表达，在心脏，肌肉和大脑等耗能高的器官里的表达尤为突出。在细胞内，主要位于在线粒体的内膜中。当线粒体受损、衰老等状态下，线粒体膜电位下降，PINK1降解减缓或者消失，使PINK1在线粒体外膜聚集。其后血浆中Parkin亦聚集到受损的线粒体上，和VDAC1等，一起成为线粒体自噬诱导的信号。
找通路具有失去的膜电位或累积的错误折叠蛋白的受损线粒体可以通过PINK1-Parkin通路去除。或者，线粒体外膜中的线粒体受体，如BNIP3L/NIX（BCL2和腺病*E1B19kDa蛋白相互作用蛋白3样/Nip3样蛋白X），BNIP3（BCL2和腺病*E1B19-kDa-相互作用蛋白3）和FUNDC1（含有FUN14结构域1）可以直接结合LC3并将线粒体导向自噬体进行降解。研究了这些线粒体自噬途径是否在WT，Becn1-Tg和Becn1+/-小鼠中对LPS有不同的刺激作用。
LPS触发了与WT心脏中的线粒体组分相关的LC3II的逐渐增加，该反应在Becn1-Tg小鼠中更大但在Becn1+/-小鼠中更低（图5A）。值得注意的是，线粒体相关的PINK1和Parkin在Becn1-Tg小鼠中最高，并且在LPS处理后它们的水平升高或维持，而这些信号在WT和Becn1+/-中的LPS后降低（图5A）。相反，LPS诱导WT和Becn1+/-心脏中线粒体定位的BNIP3L和BNIP3的增加。在Beclin-1缺陷的Becn1+/心脏中增加最明显，但在Becn1-Tg小鼠中几乎检测不到。FUNDC1水平没有发现重大变化。
通过用针对线粒体蛋白mitofusin2（Mfn2）和溶酶体蛋白Lamp1的抗体共免疫染色来证实这种检测到的线粒体自噬的趋势（图5B）。线粒体和溶酶体的共定位（以白色和淡绿色显示）随着LPS诱导而增加，并且这种趋势在Becn1-Tg小鼠中明显更强但在Becn1+/-小鼠中更弱。这些结果也与在电子显微镜下观察到的观察结果一致，即有更多的线粒体和溶酶体，其中线粒体被Becn1-Tg小鼠的常染色体膜结构吞噬并密切相关，但在Becn1+/-中更多裂解，变形的线粒体。（图5C中的基于EM图像的线粒体自噬小体和线粒体溶酶体的数量计数定量）。
与先前的报道一致，Parkin在LPS诱导的脓*症期间对心脏具有保护作用，数据表明，Beclin-1可能有助于抑制受体介导的线粒体自噬的激活，同时通过PINK1/Parkin促进更具适应性的线粒体自噬反应。
6、Beclin-1A活化肽的治疗潜力
细胞可渗透的自噬诱导肽Tat-beclin-1（TB-肽）已显示具有抗病*活性并且在心脏负荷过重情况下可以减弱心脏功能障碍。作者的研究团队，开发了一种的优化的beclin的前体，Tat-beclin-1（TB-肽）通过腹腔注射给予小鼠。作者选择了一种能够诱导足够自噬而不会引起可检测*性的剂量。正如预期的那样，TB-肽显著增强心脏自噬（图6A）。
在LPS后，TB-肽显着改善心脏功能（图6B）并减少循环细胞因子，尤其是肿瘤坏死因子-α，干扰素-γ，白细胞介素-17α和白细胞介素-6的增加（图6C）。
TB-肽干预了Becn1+/-小鼠的功能表型，证实了肽的作用机制是通过直接靶向刺激Beclin-1依赖性自噬来介导的。
当用10mg/kgLPS诱导小鼠时，与WT相比，Becn1+/-小鼠的存活率显着降低（图6D），表明Beclin-1依赖性过程在败血症中的重要性。然而，当LPS增加至15mg/kg的致死剂量时，TB-肽没有显着改善WT小鼠的存活（数据未显示）。总之，这些数据表明，TB-肽增强Beclin1依赖性自噬具有减轻败血症期间继发性器官衰竭的治疗潜力。
参考文献：
SunY,YaoX,ZhangQJ,etal.Beclin-1-dependentautophagyprotectstheheartduringsepsis[J].Circulation,,(20):-.
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