近日，派森诺生物与华东理工大学合作，在微生物基因组领域的《AppliedandEnvironmentalMicrobiology》（影响因子4.）发表新研究成果！在本研究中，从污水中分离得到了3种杀鲑气单胞菌（A.salmonicida）噬菌体，并对其生物学行为进行了研究，其中新分离得到的噬菌体vB_AsM_ZHF对A.salmonicida亚种有抑制作用。研究结果表明，该方法可能是一种替代抗生素的方法来保护鱼类免受多药A.salmonicida亚种的感染。
研究背景
杀鲑气单胞菌(A.salmonicida)是一种革兰氏阴性细菌，广泛存在于水生环境中，可感染多种商业鱼类，导致疖病和细菌性败血症。抗生素可预防和控制水产养殖中的杀鲑鱼感染，然而，随着细菌获得抗生素抗性基因，抗生素的功效会下降。从大菱鲆中分离出的A.salmonicida已对多种抗生素产生耐药性。因此，需要一些替代策略来预防和控制水产养殖中的耐多药（MDR）细菌。
噬菌体是感染细菌的病毒，噬菌体疗法已被用于控制人类、动物和植物病原体，许多成功治疗MDR细菌的方法已被报道。因此，噬菌体疗法有可能在临床上用作生物抗菌剂。在本研究种，一种剧毒的A.salmonicida亚种噬菌体vB_AsM_ZHF(ZHF)和其他两种噬菌体从污水中分离出来，并通过透射电子显微镜(TEM)鉴定为肌病毒科的成员，并对其进行全基因组测序和生物学特性验证。结果发现ZHF噬菌体治疗是一种潜在的水产养殖细菌性病害防治策略。
研究材料与方法
1.实验材料：从上海某水产市场污水中分离得到的3种A.salmonicida噬菌体，vB_AsM_ZHA、vB_AsM_ZHD和vB_AsM_ZHF。
2.测序平台：IlluminaMiSeq
3.分析内容：噬菌体全基因组测序、进化树构建、ANI分析、easyfig比较分析、耐药和毒力基因预测、噬菌体生物学特性实验等等。
研究结果
A.salmonicida亚种的分离和表征
从中国山东省大菱鲆皮肤溃疡种分离得到一个白色菌落病原菌，命名为AS01。对其进行16S进化树构建发现该菌株为A.salmonicida，但是很难区分其亚种。通过KPI体系和vapA序列进行鉴定，确定AS01菌株为A.salmonicidasubsp.masoucida亚种。
表S鉴定中使用到的菌株
三种噬菌体的分离
从上海一家水产品市场的污水中分离出噬菌体，并根据它们的噬菌斑特征选择噬菌体进行扩增。TEM检测噬菌体形态和大小以区分菌株，并对这3种分离株进行鉴定和命名：vB_AsM_ZHA(ZHA)、vB_AsM_ZHD(ZHD)和vB_AsM_ZHF(ZHF)。根据国际病毒分类委员会(ICTV)分类系统(16)的形态学特征，所有分离株都被归入肌病毒科，尾状病毒目。噬菌体ZHF在双层琼脂板上形成清晰的斑块（直径为3.28+0.25mm），具有明显的晕圈，而ZHA和ZHD分别形成直径为2.02+0.47mm和0.51+0.15mm的混浊斑块。每个噬菌体都可以感染A.salmonicida，但是不能感染A.salmonicidasubsp.salmonicida或其他测试物种。
图1A.salmonicidaphagevB_AsM_ZHA、vB_AsM_ZHD和vB_AsM_ZHF的噬菌斑和形态图。
噬菌体的生物学特性
对这三个噬菌体的生物学特性进行研究：结果发现一步生长曲线显示三种噬菌体的生长速率相似，噬菌体ZHA、ZHD和ZHF的上升期分别为30、30和20min，破裂大小为、39和PFU/细胞；把噬菌体置于各种环境下繁殖以评估稳定性，结果发现每个噬菌体在36°C下在6至8的pH水平下保持活性，当PH3并且温度高于50°C时，噬菌体滴度急剧下降。研究发现，在MOI为1时，噬菌体ZHA的最高产量约为2*PFU/ml。ZHD和ZHF的最佳MOI为0.1，噬菌体滴度达到约3*PFU/ml（图2D）。
图2A.salmonicida噬菌体vB_AsM_ZHA、vB_AsM_ZHD和vB_AsM_ZHF的生物学特性。
A.salmonicida亚种的生长曲线结果表明，在0.01至MOI的前25h内，每个噬菌体分离物都表现出可接受的抗菌能力。在MOI条件下，噬菌体ZHD感染的杀鲑鱼在25h开始重新生长，而用ZHA和ZHF感染的菌株分别在40h和45h恢复生长，其中感染噬菌体ZHF的细菌在60h时恢复率最低。该菌株的爆裂尺寸最大、细菌再生时间最长、最适MOI最低，这些特征表明，ZHF对A.salmonicidasubsp.masoucida的体外生长具有最好的抗菌活性。因此，噬菌体ZHF用于后续的实验研究。
图3显示噬菌体(vB_AsM_ZHA、vB_AsM_ZHD和vB_AsM_ZHF)在MOI为、10、1、0.1和0.01时对A.salmonicida(AS)生长的抗菌作用的生长曲线。
噬菌体vB_AsM_ZHF的基因组分析。
噬菌体ZHF基因组是一个线性DNA，由,bp组成，GC含量为41.24%；ORFs个，占基因组的,bp（92.52%），平均长度为bp。ORFs由40个结构和包装蛋白基因、27个DNA复制/修饰基因、16个转录调控基因、14个代谢基因、3个宿主裂解基因和个假设蛋白基因组成。毒力基因和耐药基因分析并未发现相关基因。ZHF可能是一种毒性噬菌体，因为在基因组中未发现整合酶基因，使其成为适合噬菌体治疗的噬菌体。
ANI分析结果显示，没有已知的噬菌体基因组与ZHF基因组表现出%相同的序列同源性，这证实了它的新颖性。全基因组序列比对表明，与其他噬菌体菌株相比，噬菌体ZHF与气单胞菌噬菌体相似性更高。虽然A.salmonicida噬菌体AS-gz的多个基因在基因组中的排列方式不同，但它们在ZHF中保留了高ANI值。噬菌体phiAS4和AES以及窄食单胞菌噬菌体IME13的许多基因序列与ZHF相同。其他被分析的噬菌体具有与ZHF同源的结构蛋白，但与其他蛋白质的相似性较少。
图4杀鲑鱼噬菌体vB_AsM_ZHF的基因组特征及比较分析。
噬菌体vB_AsM_ZHF对A.salmonicidasubsp.masoucida的治疗效果。
在大菱鲆中建立A.salmonicidasubsp.masoucida的挑战模型，每组20只大菱鲆接受1*、1*或1*CFU/鱼的i.m.挑战。接种后20天(dpi)的存活率分别为60%、10%和0%。选择8*CFU/鱼作为A.salmonicidasubsp.masoucida的攻击剂量，在接下来的实验中大菱鲆感染了该菌，通过ZHF治疗发现，ZHF有可能保护大菱鲆免受A.salmonicidasubsp.masoucida的侵害。
图5用8*CFU/鱼和噬菌体vB_AsM_ZHF(ip)以8*PFU/鱼(MOI为0.01)、8*PFU/鱼的剂量处理的大菱鲆的存活率。
在体内评估细菌负荷和噬菌体滴度，以表征ZHF对A.salmonicidasubsp.masoucida的动态特性，结果发现在肝脏和脾脏中细菌负荷和噬菌体滴度的变化趋势相似。在最初的2天，肝脏和脾脏中未检测到细菌定植，但在接下来的几天中逐渐增加。与CFU/g的阴性对照相比，治疗组的细菌负荷上升至约CFU/g。在头肾组织中，治疗组的细菌负荷在8天内保持低于阴性对照，并且稳定增长。在前2天，治疗组和对照组之间的噬菌体滴度没有差异，但治疗组的噬菌体滴度比对照组下降得更慢。在肝脏和脾脏中，处理组中噬菌体滴度迅速下降8dpi；而在对照组中，噬菌体ZHF被完全清除。与其他器官相比，头肾组织中清除ZHF的速度更慢。综上所述，ZHF有效地减轻了头肾组织感染的细菌负担，大菱鲆的免疫系统对噬菌体的清除具有延缓作用。
图61、2、4和8dpi时肝脏、脾脏和肾脏中的细菌负荷（左轴）和噬菌体滴度（右轴）。
A.salmonicidasubsp.masoucida的抗炎作用。
肌肉组织病理切片显示，A.salmonicidasubsp.masoucida在8dpi时可导致炎症细胞浸润，噬菌体治疗后可显著减少炎症细胞的数量进而达到对照组的水平。ZHF相对于细菌感染组1至4dpi降低血清中白细胞介素1b（IL-1b）水平，并且在8dpi时血清TNF-a和γ干扰素（IFN-g）水平低于对照组dpi。炎症因子（IL-1b、IL-6、IFN-g、转化生长因子b[TGF-b]、肿瘤坏死因子α[TNF-a]和铁调素）在1、2、4、通过实时定量PCR测量肝脏、脾脏和头肾中的8dpi，并通过热图进行可视化。治疗组的TGF-b水平高于感染组，尤其是在8dpi时。相比之下，治疗组第8天IL-1b、第1天IL-6、第2天和第4天脾脏中的IFN-g、第8天铁调素水平低于感染组。这些结果表明，噬菌体疗法有效地降低了体内炎症水平。
图7体内噬菌体疗法的抗炎作用
研究结论
1.从污水中分离了一种新的A.salmonicidasubsp.masoucida噬菌体ZHF，并对其生物学特性进行了鉴定；
2.对全基因组进行测序分析，未发现抗生素耐药性或毒力基因；
3.噬菌体治疗模型在大菱鲆体内建立和验证了给药方法，结果发现ZHF显着降低了死亡率、细菌负担和炎症反应，且没有明显的副作用。
综上所述，本研究代表了一种开发噬菌体疗法来控制多重抗生素耐药性A.salmonicidasubsp.masoucida的策略。
本研究的denovo测序和部分数据分析由上海派森诺生物科技有限公司完成。
